Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

Io sono te. Lavoro nel laboratorio di Anton James. Oggi vi mostrerò come fare la microiniezione negli embrioni di DGA in Egitto allo scopo di ottenere zanzare transgeniche.

Per ottenere gli embrioni per le micro iniezioni, abbiamo bisogno di avere una femmina nutrita con il sangue. Le femmine dovrebbero essere nutrite giovedì. Se vuoi fare una microiniezione dal lunedì al venerdì, anche questa è una vile.

Prendo il cotone, lo metto e verso l'acqua. Il cotone dovrebbe essere bagnato e prendere un cerchio di tre mm di bianco, metterlo sopra e spingere verso il basso. E devo versare l'acqua, pulire il tetto, il tovagliolo e chiudere con il cotone.

Questo è pronto In questo momento sto per raccogliere sei femmine da 10 e trasferisco le femmine per ritirarsi per un po' e le metterò in condizioni di buio e le metterò nella camera, che ha un celam di 27 gradi per un'ora e 15 minuti. Sto realizzando aghi per la microiniezione utilizzando aghi di vetro e stiamo utilizzando la società di strumenti Polar Shuttle e il modello P 87. Metto un ago di vetro nell'anello e lo fisso da entrambi i lati.

Chiudere il coperchio e spingere l'ago è rosso. Ora ti mostrerò come fare il collegamento degli aghi. Gli aghi dopo aver tirato sono chiusi e dobbiamo riaprire gli aghi.

Ci sono due modi per farlo. Un modo è essere collegato e un altro modo basta toccare l'embrione prima delle iniezioni. Ok, questo è il modo di Lin.

Ho l'ago e fisso questo ago qui. Ecco sopra la punta che non possiamo usare per la micro iniezione. Questa punta per la micro iniezione, abbiamo bisogno di avere la punta aperta.

Questa è la ruota. Cerco di toccare la superficie della ruota con l'ago e le punte dell'ago devono toccare la superficie della ruota. Quando la punta tocca la superficie, devi mettere la rotella.

Qui puoi vedere che l'ago è pronto per la microiniezione. La punta dell'ago è e si può vedere che la punta è brillante. Questo, questo significa che l'ago è aperto e pronto per la microiniezione.

Ricorda, solo l'estremità del tubo deve essere rotta. Se fai un grosso buco, l'ago non va bene. Il foro deve essere molto piccolo.

È passata un'ora e 15 minuti e gli embrioni dovrebbero essere pronti per le micro iniezioni che sto prelevando dalla camera. Prenditi un po' e puoi vedere gli embrioni, una dose nera sulla carta e in questo momento sto trasferendo le femmine nella gabbia. Lasciali semplicemente volare.

Ora vi mostrerò gli strumenti che utilizzerò per l'allineamento degli embrioni. Questo mi costringe a prendere la carta X da wild. Queste forze che sto usando per fare la linea dell'embrione.

Il Cesare, dobbiamo tagliare il nastro biadesivo e queste forze le sto usando per estrarre le uova dopo le micro iniezioni. Questo è il foglietto di copertura. A questo foglietto di copertura.

Attacco un nastro biadesivo per raccogliere gli embrioni dalla carta watman. Ora allineerò gli embrioni. Il primo lo sto prendendo dal foglio X dal momento.

Bisogna ricordare che la carta deve essere sempre bagnata. Ho intenzione di allineare gli embrioni dal grigio al grigio scuro. Questa è una buona fase per le iniezioni.

Non prendere embrioni bianchi e neri, tutti gli embrioni devono avere lo stesso orientamento. Abbiamo due poli, Ontario e poster che inietteremo in Posterial.End. Il lato dell'Ontario è un po' largo rispetto a quello posteriore.

Questo è un vetrino coprioggetto. Farò un foglietto di copertura pronto per raccogliere gli embrioni. Per questo, ho bisogno di del nastro biadesivo attaccato alla copertina.

Slittare, tagliare, invecchiare e il vetrino coprioggetto è pronto. In questo momento ho bisogno di asciugare molto bene la carta X perché se gli embrioni sono bagnati, non si attaccano mai al nastro. Per questo, sto usando MV senza asciutto. In questo momento sto prendendo il vetrino di copertura e il nastro adesivo a doppia bistecca e premo leggermente sugli embrioni.

E ho degli embrioni sul foglietto di presentazione. E proprio ora c'è questo passaggio di dizione. Questo passaggio di dizione dovrà per lo più attendere in questa posizione circa un minuto, forse.

Ma devi guardare al microscopio e puoi vedere che le uova iniziano a restringersi. Questi embrioni vengono essiccati. Puoi vedere le fossette e quando vedi queste fossette devi mettere immediatamente l'olio e fermare l'essiccazione.

Quando gli embrioni vengono essiccati, bisogna mettere immediatamente l'olio. Gli embrioni sono pronti per la microiniezione E sto mettendo gli embrioni di linea sul palco e sto per riempire gli aghi, il DNA per questo. Sto usando il tubo di aggiunta e l'ago di caricamento anche da aggiungere da qui.

E sto prendendo il mio DNA prendendo 1,5 microlitri. Va bene e caricare e l'ago e ho fissato l'ago al supporto. E hol è collegato al micro iniettore.

Stiamo utilizzando un micro iniettore einor, che chiama getto Femto. Ora sono pronto per iniettare gli embrioni. Per queste carte stiamo usando la pressione di iniezione 600, la contropressione 250 e il tempo è manuale.

In questo momento vedo embrioni molto perfetti al microscopio. E dopo di che sposto l'ago e devo anche vedere molto perfettamente e mettere a fuoco l'ago nel microscopio. Dopodiché, rimetto gli embrioni e posso vedere embrioni e ago nello stesso campo.

E in questo momento attacca l'ago molto vicino all'estremità posteriore degli embrioni. E sto facendo l'iniezione a un'estremità posteriore degli embrioni. E per prima cosa devo vedere gli embrioni molto chiari al microscopio.

Sposto il tavolino del microscopio e vedo sempre dove l'ago non si muove. Buona iniezione. L'iniezione perfetta.

Quando vedete l'estremità posteriore e raggiungete un ago, toccate la parte posteriore e la penetrate e non riuscite a vedere alcun rimpicciolimento della X, nessun rimpicciolimento del genere. Se lo fai così, non è molto buono. Ma se x è ancora nella posizione in questo modo e si penetra l'ago, significa che l'ago è molto buono e l'iniezione è molto buona.

Dopo la microiniezione, devo trasferire gli EMRE, in condizioni di bagnato. Per questo, sto usando una camera di plastica con cotone bagnato sul fondo e carta bagnata. Metto questo mio sul cotone e sono sicuro che questa carta sia bagnata.

Questo è pronto. Sto prendendo la mia forza. Sto insegnando agli embrioni sotto l'olio e sto mettendo il muro sulla carta.

Per favore, non mettete il fondo, perché l'olio deve scendere dall'embrione e io, sto prendendo 2, 3, 5 embrioni in una volta o una, va bene anche questo. Ora preparerò gli embrioni in modo che siano pronti per l'insetto. Per questo sto prendendo la salvietta parentale, copro gli embrioni e li fisso con la gomma.

E questo è pronto per l'insetto per cinque giorni. Poi rimaniamo nell'ispezione per cinque giorni e dopo di che andremo a schiuderci con l'embrione, eh, e prenderemo i transgenici. Ora sono in ECT e vi mostrerò come far schiudere gli embrioni.

E la prima cosa verserò l'acqua nella camera di plastica e aggiungerò il cibo. Gocce di coppia, prendere gli embrioni, che rimangono in un alimento insectory cinque giorni. Prendete la carta per le uova, fate un piccolo foro e mettete giù gli embrioni.

Questo è tutto. Gli embrioni iniziano a schiudersi dopo la prima volta nella prima settimana. E anche alcuni embrioni iniziano a schiudersi dopo quattro settimane.

E abbiamo sempre nella sabbia, diversi stadi di larva e pu, ho solo mostrando per voi come fare la microiniezione in un dete embrioni. E voglio dire che tre passaggi sono molto importanti in questa procedura. Devi fare degli aghi molto buoni.

Devi raccogliere gli embrioni nella fase giusta. L'essiccazione deve essere fatta anche in modo molto preciso, non troppo. Tra circa quattro settimane avremo zanzare transgeniche.