Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

Lo scopo di questa procedura è quello di esprimere recettori funzionali antigene-specifici delle cellule T su cellule T di topo. In primo luogo, trasfettare una linea cellulare produttrice di retrovirali con un plasmide contenente il gene TCR di interesse per impacchettare il retrovirus che esprime TCR. Successivamente, isolare e purificare le cellule T dalla milza di topo infettare queste cellule T purificate con il retrovirus prodotto nella prima fase.

Infine, espandere le cellule T trasdotte per esprimere e ottenere livelli apprezzabili di recettore. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'espressione di TCR antigene specifici funzionali su cellule T di topo attraverso la citometria a flusso. Ciao, mi chiamo Michelle Crow Guard.

Sono al NYU Cancer Institute presso la NYU Medical School. Oggi vi mostreremo come trasdurre le cellule T primarie, le persone che vi mostreranno come farlo saranno Shiong, un postdoc in laboratorio, Kaleena Melek, una studentessa laureata in laboratorio, e Arian Perez Garcia, un postdoc in laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i topi transgenici è che richiede molto meno tempo.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande immunologiche chiave, come ad esempio quale TCR può dare una risposta migliore contro gli antigeni. Questa tecnica può essere applicata per la terapia di trasferimento adottivo delle cellule T, che si è dimostrata promettente per il trattamento dei pazienti oncologici e consiste nella modifica in vitro delle cellule T umane per garantire un'espressione uniforme delle catene alfa e beta del recettore delle cellule T. Subclonare il gene di interesse nello stesso vettore retrovirale sotto il controllo dello stesso promotore.

Prepara il DNA plasmatico di alta qualità utilizzando il kit di preparazione Kyogen Maxi e crea una scorta di un microgrammo per microlitro. Rimuovere il terreno dalla piastra con le celle di confezionamento retrovirale in platino E e lavare la piastra una volta con un XPBS. Smuovere le cellule aggiungendo tripsina EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per alcuni minuti.

Neutralizzare le cellule rimosse con terreno DMEM e trasferirle in una provetta di falco. Quindi centrifugare le celle a 1000 volte G per cinque minuti. Aspirare il supinato e risospendere il pellet cellulare in terreno DMEM.

Determinare il numero di cellule e diluire le cellule a 0,6 volte 10 per la piastra da sei per millilitro. 10 millilitri di sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale rivestita di polilisina da 10 millimetri e crescere per una notte in un incubatore cellulare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. La mattina successiva, esaminare le cellule al microscopio ottico per verificare circa l'80% di fluenza del co.

Rimuovere delicatamente il supporto dalla piastra. Lavare le cellule una volta con un XPBS e aggiungere 10 millilitri di terreno DMEM fresco preriscaldato senza penicillina o streptomicina. Per il complesso di trasfezione media a labbro, preparare due miscele e opti ME M1 di DNA e l'altro di reagente per lipectomia equilibrare separatamente per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti. A temperatura ambiente, sgocciolare lentamente il composto nelle celle di platino E. Agitare delicatamente la piastra avanti e indietro per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione.

Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore cellulare. Dopo sei-otto ore, sostituire il terreno con 10 millilitri di terreno DMEM fresco per la produzione virale. Raccogli una milza di topo e trasferiscila nel terreno RPMI.

Mettere la milza in un colino cellulare. Schiacciare la milza con uno stantuffo a siringa in una piastra di coltura tissutale di cinque centimetri. Sciacquare le cellule dal filtro cellulare con PBS sterile per raccogliere le cellule e centrifugare a 1000 volte G per cinque minuti.

Eliminare il supponante. Continuare con Resus sospendendo il pellet cellulare in un tampone di lisi CK. Aggiungendo due millilitri per milza, incubare per due minuti.

A temperatura ambiente. Aggiungere il mezzo RPMI fino a 20 millilitri e centrifugare a 1000 volte G per cinque minuti. Infine, risospendere il pellet cellulare in PBS sterile.

Determinare il numero di celle e centrifugare a 1000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Al fine di attivare le cellule T di topo prima della trasduzione virale rivestono le piastre con anticorpi attivanti, vale a dire anti CD tre epsilon e anti CD 28. Preparare una miscela di anticorpi di un microgrammo per millilitro di anti CD, tre epsilon e due microgrammi per millilitro di anti CD 28 in PBS sterile, erogare 250 microlitri della miscela di anticorpi in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti e incubare per due ore a 37 gradi Celsius.

Etichettare magneticamente le cellule della milza secondo il manuale del prodotto. Posizionare una colonna LS nel campo magnetico. Applicare la sospensione cellulare etichettata sulla colonna.

Raccogliere il flusso attraverso il CD di topo arricchito otto più cellule T. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone e in combinazione con il precedente blow through. Colorare le cellule con anticorpi anti CD tre epsilon e anti CD otto alfa e analizzare la citometria a flusso.

Quindi, centrifugare le cellule a 1000 volte G per cinque minuti e risospendere la pelle cellulare a 1 milione di cellule per millilitro in terreno RPMI con IL 2 umano ricombinante. Rimuovere la soluzione di anticorpi dalla piastra di attivazione. Sciacquare ogni pozzetto con PBS sterile.

Aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a ciascun pozzetto e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius. 5% di anidride carbonica in un incubatore cellulare. Dopo due giorni dalla produzione del virus, il terreno nella piastra cellulare ESE al platino dovrebbe diventare giallo.

Trasferire il supinato virale in una provetta conica da 15 millilitri per rimuovere i detriti cellulari. Centrifugare il surnatante del virus S a 1000 volte G per cinque minuti. Trasferire con cautela il virus supinato in una nuova provetta.

Lasciare un po' di liquido sul fondo della provetta e non disturbare i detriti cellulari. Raccogliere le cellule T attivate dalla piastra in un tubo conico da 50 millimetri. Determina il numero di cella.

Conservare alcune cellule in una provetta separata da utilizzare come centrifuga di controllo negativo a 1000 volte G per cinque minuti e scartare il natante supino. Quindi risospendere il pellet cellulare in posizione supina del virus. Natante a 10 alle sei cellule per millilitro con 20 nanogrammi per millilitro di umano ricombinante, interleuchina due e 10 microgrammi per millilitro di proteina solfato.

Aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti per la provetta di controllo. Resus. Sospendi le cellule in terreno RPMI alla stessa densità cellulare con la stessa quantità di umano ricombinante, interleuchina due e solfato proteico. Aggiungi le celle alla stessa piastra.

Avvolgere la piastra con pellicola di plastica da centrifuga per 90 minuti a 2000 volte G a 32 gradi Celsius senza interruzioni. Dopo la centrifugazione, rimuovere la pellicola di plastica. Aggiungere un millilitro di terreno RPMI fresco con 20 nanogrammi per millilitro di interleuchina umana ricombinante due per ciascuno, rimettere bene la piastra nell'incubatrice.

È importante esaminare quotidianamente le cellule T trasdotte. Dividi le celle in uno o tre rapporti quando necessario. Non lasciare che le cellule crescano eccessivamente o lasciare che il terreno ingiallisca al sesto o al settimo giorno.

Colorare le cellule con anticorpi e tetramero MHC specifico per il TCR per valutare l'espressione del TCR sulla superficie delle cellule T. Utilizzare le cellule T UNSD come controllo. Queste cellule T trasdotte sono ora pronte per ulteriori applicazioni a valle.

Prima della trasduzione virale. È vantaggioso ottenere sottogruppi di cellule T ad alta purezza utilizzando biglie magnetiche commerciali per valutare il livello di espressione dei TCR sulle cellule T. Possono essere utilizzati anticorpi specifici per le catene TCR alfa o beta.

Tipicamente, dal 30% all'80% delle cellule può esprimere TCR trasdotto a seconda dei geni TCR e dei titoli virali. Il tetramero MHC specifico per il TCR può essere utilizzato anche per verificare ulteriormente l'espressione funzionale dei TCR. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le cellule in condizioni sane Dopo questa procedura. Altri metodi, come i saggi di citotossicità, di rilascio di acido o citochine, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come la specificità e la sensibilità del trasduco. I TCR.

Dopo aver visto questo video, dovresti essere un esperto nel trasduzione del tuo TCR preferito in cellule T primarie. Ci vediamo in laboratorio.