Espansione ex vivo di tumore cellule T reattive per mezzo di 1/Ionomycin Bryostatin e il Comune catena gamma Citochine Formulazione

Gli obiettivi di questo esperimento sono indurre l'attivazione delle cellule T da parte della micina delle statine di Brios, così come la differenziazione delle cellule T da parte delle citochine a catena gamma iniziando con l'isolamento delle cellule T sensibilizzate al tumore dalla milza e dai linfonodi. Quindi attivare con brios la statina uno e lo ione micina due mimetici del segnale intracellulare che aumentano rispettivamente l'attività della proteina chinasi C e il calcio intracellulare. Coltura in presenza di IL sette, IL 15 e IL due per la differenziazione e l'espansione delle cellule T reattive al tumore.

La potente combinazione dei risultati dell'interferone gamma EISA e il test di citotossicità possono far luce sulla reattività tumorale delle cellule T espanse e offrire potenziali spunti per l'immunoterapia adottiva. Questo metodo di espansione exvivo delle cellule T reattive al tumore può aiutare a rispondere a domande chiave nell'immunologia dei tumori, come ad esempio qual è il ruolo delle comuni citochine di imaging gamma nella differenziazione delle cellule T reattive al tumore. E qual è il ruolo di ciascun fenotipo di cellula T come le cellule effettrici, le cellule della memoria effettrici e le cellule della memoria centrale nella generazione di una risposta di memoria a lungo termine contro il cancro.

L'isolamento dei linfonodi e della milza e la gestione settica dei linfociti sono procedure difficili da implementare, ma possono essere apprese rapidamente. Con l'osservazione. I topi femmina transgenici FVBN 2 0 2 esprimono un nuovo transgene di ratto inattivato sotto la regolazione del promotore MMTV e, di conseguenza, hanno sviluppato un carcinoma mammario spontaneo tra i quattro e i 10 mesi di età.

In questo protocollo, questi topi portatori di tumore spontaneo vengono utilizzati come donatori di cellule T reattive al tumore. Per iniziare, isolare i linfonodi drenanti tumorali e la milza da topi transgenici portatori di tumore FVBN 2 0 2. Ora preparare una sospensione a singola cellula in RPMI 1640 ghiacciato integrato con una coltura al 10% di FB sce A a 10-6 cellule per millilitro in terreno completo contenente il 15% di FBS con un cin micromolare, cinque nano molari brios statine uno e 80 unità per millilitro.

IL due per 16 ore con il nostro terreno PMI equilibrato a 37 gradi Celsius, lavare le cellule tre volte, quindi coltivare a 10 alle sei cellule per millilitro in terreno completo con 10 nanogrammi per millilitro, ciascuno di IL sette e IL 15 per 24 ore. Per attivare ulteriormente l'impulso cellulare con un'aggiunta di 40 unità per millilitro IL due per 24 ore. Ora dividi le cellule e coltivale con 10 nanogrammi per millilitro, ciascuna di IL sette e IL 15 per altri quattro giorni se necessario, cambia il terreno e dividi le cellule ogni due giorni.

Raccogliere le cellule T primarie espanse mediante centrifugazione, enumerare le cellule mediante microscopia ottica e calcolare l'espansione della piega delle cellule T. Ora prepara le cellule per la citometria a flusso per determinare la proporzione di cellule T CD otto positive e CD quattro positive. In primo luogo, bloccare il legame non specifico degli anticorpi ai recettori FC incubando le cellule con anticorpi anti CD 16, CD 32 per 20 minuti su ghiaccio.

Quindi lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS ghiacciato integrato con azoturo di sodio all'1% per colorare le cellule incubando con gli anticorpi Fitz CD quattro e PE CD otto per 20 minuti sul ghiaccio. Lavare due volte con due millilitri di PBS ghiacciato integrato con l'1% di FBS e lo 0,1% di azoturo di sodio. Infine, fissare le cellule con l'aldeide paraforme all'1% e analizzare i campioni su un Beckman Coulter FC 500 utilizzando il software Summit versione 4.3 in piastre di coltura a sei pozzetti, pipettare le cellule T con cellule tumorali mammarie in un rapporto effettore/bersaglio di 10 a uno e tre millilitri per pozzetto.

Il terreno completo contenente 20 unità per millilitro di IL 2 incubare a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per 48 ore. Eseguire la colorazione con anticorpi a tre colori per le nuove, seguite da PE anti-US IgG e Xin cinque fite e ioduro di propidio secondo il protocollo del produttore sui fatti del gate sulle nuove cellule tumorali positive e analizzare la vitalità delle cellule tumorali con uno Xin cinque pi. Un'attivazione delle cellule T con BI per 16 ore provoca l'uccisione delle cellule T naive che non sono sensibilizzate con il tumore in vivo.

Dopo la bi selettività delle cellule T reattive al tumore, si espandono fino a 2,8 volte entro una coltura di sei giorni con le citochine a catena gamma, sia le cellule T CD otto positive che le cellule T CD quattro positive sono ugualmente espanse con le citochine a catena gamma. Dopo una coltura ex vivo di sei giorni, le cellule T espanse ex vivo mostrano un'elevata reattività contro i tumori a cui i topi donatori sono stati sensibilizzati, come valutato dalla produzione di interferone gamma. In presenza di nuove cellule tumorali mammarie di topo positive o MMC, le cellule T espanse ex vivo possono indurre l'apoptosi nelle nuove cellule tumorali MMC positive, in modo tale che la vitalità delle cellule tumorali scenda dal 92% al 61% entro 48 ore.

Durante il tentativo di questa procedura, è necessario ricordarsi di lavorare in condizioni asettiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come selezionare ed espandere le cellule T attive del tumore per la terapia adattiva con cellule T dei tumori.