Microiniezione di batteri nella vena caudale degli embrioni di pesce zebra

Prendi embrioni di pesce zebra in fase iniziale sospesi in acqua di pesci e rimuovi il corione, la membrana protettiva che circonda gli embrioni.

Trasferire gli embrioni in una camera di posizionamento a V piena di acqua di pesce contenente un agente anestetico per immobilizzarli per la microiniezione.

Posiziona gli embrioni all'interno della camera.

Successivamente, diluire una sospensione omogenea di batteri patogeni marcati con fluorescenza in un tampone contenente detergenti per minimizzare gli aggregamenti batterici.

Aggiungi un colorante tracciante per facilitare il monitoraggio dell'iniezione.

Carica la sospensione in un ago per microiniezione, monta l'ago su un micromanipolatore e rompi la punta per creare una piccola apertura.

Riposiziona l'embrione con il lato ventrale rivolto verso l'ago e avvicina la punta dell'ago all'apertura urogenitale.

Inserisci delicatamente la punta nella regione della vena caudale e inietta la sospensione batterica.

Trasferire gli embrioni su una piastra multi-pozzo contenente acqua per i pesci per ulteriori studi di interazione ospite-batterico.

Per eseguire la microiniezione di M. Ascesso circa 24 ore dopo la fecondazione o HPF, usa una pinzetta per decorionare gli embrioni in una piastra di Petri da 100 millimetri e mantenerli a 28,5 gradi Celsius.

Trasferire 30-48 embrioni hpf in una camera di posizionamento a V riempita con 25 millilitri di acqua per pesci contenente 270 milligrammi per litro di tricaina. Con una punta micro loader tagliata, posiziona correttamente gli embrioni nei canali per una micromanipolazione più facile.

Usa PBST con 0,05% Tween 80% per diluire l'inoculo microbatterico fino alla CFU desiderata da somministrare, e includi il 10% di fenolo rosso per verificare la corretta iniezione. Con una punta microcaricatrice, carica un ago per microiniezione con 5-10 microlitri dell'inoculo batterico.

Collega l'ago per microiniezione al supporto di un micromanipolatore collegato all'iniettore e usa pinzette sottili per staccare la parte superiore dell'ago e ottenere un diametro di apertura da 5 a 10 micrometri.

Calibra il volume di iniezione regolando la pressione e il tempo della microiniezione. Poi, per ottenere il volume di iniezione richiesto, si misura il diametro di una goccia espulsa nel tuorlo di un embrione.

Per microiniettare nella vena caudale, posiziona l'embrione con il lato ventrale rivolto verso l'ago e posiziona la punta dell'ago vicino all'apertura urogenitale e spingi delicatamente la punta dell'ago nell'embrione finché non perfora appena la regione della vena caudale.

Poi somministra il volume desiderato di sospensione batterica, solitamente da 1 a 3 nanolitri contenenti circa 100 CFU per nanolitro. Incubare e monitorare gli embrioni secondo il protocollo testuale.