Name: Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Impara a preparare sezioni istologiche di muscoli toracici di Drosophila in paraffina e congelate. Questa tecnica consente di analizzare la morfologia muscolare e localizzare le proteine con precisione.

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Ringraziamo il Prof. Eichele per averci permesso di usare il crio-microtomo. Il lavoro è stato finanziato dal Max-Planck-Gesselschaft.

1. Preparazione <ol><li> Appena preparare fissativo Carnoy combinando etanolo assoluto, cloroformio ed acido acetico glaciale in proporzione 6:03:01 rispettivamente. 3 Questo, così come tutte le soluzioni per colletti sommergendo deve essere conservato in barattoli di vetro colorazione (vedi sezione reagenti per la raccomandazione). </li><li> Preparare un foglio di alluminio tasche il formato corretto per i collari. </li><li> Preparare le seguenti soluzioni in colorazione barattoli: 2 X 40% etanolo, 70% di etanolo, 2 X 100% etanolo, methylbenzoate (MB), 50/50 v / v MB e paraffina, 2 X paraffina. Posizionare il MB e contenitori di paraffina in un insieme incubatore a 60-65 ° C. </li><li> Paraffina calda versare nelle tasche di pellicola a 60-65 ° C. </li></ol> 2. Fissaggio mosche in Collari <ol><li> Fissare i 4 collare sotto il binoculare con del nastro in una posizione verticale su cui si può vedere il punto di ingresso per la mosca. </li><li> Anestetizzare vola con anidride carbonica o tramite ipotermia utilizzando un blocco di ghiaccio. Fare attenzione a non congelare le mosche. </li><li> Utilizzando pinze, pick up vola singoli afferrando le ali e il luogo nel colletto orientata correttamente (testa e torace in cima delle pale e l'addome sotto le lame). 10-20 vola dovrebbe facilmente adattarsi al collo. </li></ol> Nota: Se si sta analizzando genotipi diversi, non dimenticate di prendere nota del numero colletto e genotipo corrispondente. 3. Sezioni di paraffina toraci Drosophila <ol><li> Spostare il collare per la soluzione di Carnoy e fissare il tessuto a 4 ° C durante la notte. </li><li> Dopo la fissazione, disidratano l'esempio utilizzando concentrazioni crescenti di etanolo. Per 10 minuti ogni immergere il collare in 40% (2 volte), 70% e 100% (2 volte) etanolo a temperatura ambiente. Collare incubare prossimo in MB e MB di paraffina soluzione + (1:1) per 30 minuti in ciascuna e quindi infiltrarsi il collare in due cambi di paraffina per 60 minuti ciascuno a 60-65 ° C. Spostare rapidamente il collare nella tasca foglio e riempire con il fuso (60-65 ° C) paraffina. Metterlo a temperatura ambiente e permettono la paraffina per diventare difficile (si consiglia di lasciare per una notte). Si noti che il collare può essere messo in tasca foglio in diversi orientamenti, a seconda dell'orientamento delle sezioni che vi servono (longitudinale o trasversale). </li><li> Separa i blocchi di paraffina a secco con collari dal foglio separato e delicatamente il collare dal blocco di paraffina. Con l'aiuto di una lama affilata o bisturi tagliare con precisione l'olio extra-paraffina provenienti da tutto il tessuto volare. </li><li> Tagliare il blocco di paraffina con passaggi 7-10 micron sezione su un microtomo rotazione e permettere il tessuto tagliato a galleggiare appartamento in un bagno d'acqua a 37 ° C. Posizionare il tessuto sezionato su vetrini polari e l'essiccazione durante la notte. Queste diapositive possono essere utilizzate per la colorazione con hematoxyline e eosina (Figura 1A-D), blu di toluidina, blu di anilina o altro muore per visualizzare le strutture dei tessuti, così come per la colorazione anticorpale (Figura 1E-E ``). </li></ol> 4. Criosezioni di toraci Drosophila <ol><li> Come nel caso di sezioni di paraffina, preparare le mosche in un collare e della moda una tasca un foglio di alluminio. Un dispositivo di raffreddamento congelamento saranno necessari per la preparazione dei campioni. Assicurarsi che il dispositivo di raffreddamento è di circa -60 ° C, usare un po 'di etanolo e ghiaccio secco per consentire il raggiungimento di tale temperatura. Un'ora prima di iniziare l'esperimento messo la bottiglia di crio-embedding media (Tissue-Tek composto ottobre) a testa in giù in un 4 ° C in frigo per raffreddarlo e ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria. </li><li> Riposizionare il collare con le mosche per la tasca foglio che è stato pre-raffreddata per diversi minuti all'interno del refrigeratore congelamento e rapidamente riempire con la crio-embedding composto. Lasciate che il congelamento del campione per 3-10 min. Scartare con cura il blocco costituito all'interno del radiatore, separare delicatamente il collare dal blocco embedding e metterlo a -20 ° C per almeno un giorno. </li><li> Tagliare i muscoli congelati su un crio-microtomo tra -15 e -18 ° C con uno spessore di sezione di 10-15 micron. Posto su vetrini polarizzati e conservare a -20 ° C fino al momento di fare ulteriori elaborazioni. Ti suggeriamo di fissaggio del tessuto in una soluzione di formaldeide al 4% PBS per 10 minuti a temperatura ambiente prima della colorazione degli anticorpi. </li></ol> 5. Rilevamento lipidi nei muscoli Drosophila Gocce lipidiche possono essere rilevati con l'olio rosso O macchia criosezioni utilizzando un protocollo adottato da Sieber e Thummel 5. <ol><li> Dopo la fissazione, lavare i vetrini con acqua due volte per 5 min, equilibrati in glicole propilenico per 10 minuti e incubare per 3 ore in olio rosso O macchia a temperatura ambiente. Quindi lavare i campioni per 2 volte per 5 min in glicole propilenico e 30 minuti in PBS. Monte nel 30% glicerolo. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> FicoURE 1. Kerosene-embedded sezioni Hematoxyline e eosina macchiato trasversale (AB) e longitudinale (CD) sezioni di muscoli volo indiretto. A e C mostra i muscoli normale strutturato. Anormale dai muscoli dimensioni e morfologia sono rappresentati in B e D, rispettivamente (frecce nere). Sezione trasversale del torace macchiato Drosophila con anti-LAMC, marcatore involucro nucleare e DAPI, nucleare macchia (EF). Visualizzazione ingrandita della normale (freccia rossa) e peggiorata (freccia gialla) muscoli (F). G rappresenta la sezione di Drosophila macchiato tratto intestinale con LAMC e DAPI. <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Le sezioni congelate A. Sezioni trasversali congelati torace macchiato di Drosophila con l'olio rosso O, etichetta di goccioline lipidiche. B. sezioni longitudinali congelati dei muscoli volo indiretto colorati con anti-Dg, il muscolo sarcolemma marcatore e DAPI.

<ol><li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).</li>
<li>Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+muscle+and+neuronal+disorders+in+a+Drosophila+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy.</a> The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).</li>
<li>Kucherenko, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modifier+screens+reveal+new+components+that+interact+with+the+Drosophila+dystroglycan-dystrophin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex.</a> PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).</li>
<li>Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carnoy+fixation%3A+practical+and+theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemie%22%5BJournal%5D)">Carnoy fixation: practical and theoretical considerations.</a> Histochemie. 16, 361-36 (1968).</li>
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<li>Sieber, M. H., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DHR96+nuclear+receptor+controls+triacylglycerol+homeostasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila.</a> Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<table><tbody><tr><td>Collari in acciaio inossidabile</td><td>Autoprodotti</td><td></td><td>Costruiti appositamente</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama o bisturi</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso da macrostaining Wheaton</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Modello: Hyrax M25</td></tr><tr><td>Criomicrotomo</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Modello CM3050S</td></tr><tr><td>Incubatrice a 60-65&amp;#x00B0;C</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Di dimensioni sufficienti per contenere almeno 4 vasi da colorazione</td></tr><tr><td>Congelatore con blocco metallico</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Conservare a -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Vetrini Super-frost</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>9161155</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Si raccomanda 24 x 40 mm</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100063</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Etilene</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100983</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Metilbenzoato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M29908-500G</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76258</td><td>Paraffina</td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide al 16%, priva di metanolo</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

sezioni incluse in paraffina e surgelati di drosophila adulti muscoli

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

La caratterizzazione molecolare delle distrofie muscolari e miopatie nell&#39;uomo non hanno rivelato la complessità della malattia muscolare e l&#39;analisi genetica di specifica dei muscoli, la formazione e la funzione in sistemi modello ha fornito informazioni preziose in fisiologia muscolare. Pertanto, l&#39;individuazione e la caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base danno muscolare è critica. La struttura di adulti Drosophila multi-fibra muscolare assomigliano vertebrati muscoli striati 1 e la trattabilità genetica della Drosophila ha fatto un grande sistema per analizzare la morfologia distrofica muscolare e caratterizzano i processi che interessano la funzione muscolare in età adulta vola 2. Qui vi presentiamo la tecnica istologica per la preparazione inclusi in paraffina e congelati sezioni dei muscoli toracici Drosophila. Queste preparazioni consentono di tessuto da macchie colorate con classica istologici ed etichettato con coloranti proteine ​​rilevazione, e in particolare criosezioni sono ideali per la rilevazione immunoistochimica di proteine ​​nei muscoli intatti. Questo permette di analisi della struttura del tessuto muscolare, l&#39;identificazione di difetti morfologici e la rilevazione dei pattern di espressione per il muscolo / neuroni specifici per le proteine ​​nei muscoli adulti Drosophila. Queste tecniche possono anche essere leggermente modificato per il sezionamento di altre parti del corpo.

Identificazione dei meccanismi alla base danno muscolare è cruciale. Qui vi presentiamo la tecnica istologica per la preparazione inclusi in paraffina e congelati sezioni dei muscoli toracici Drosophila. Questo permette l&#39;analisi della morfologia muscolare e la localizzazione di proteine ​​e altri componenti delle cellule muscolari.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

La caratterizzazione molecolare delle distrofie muscolari e delle miopatie nell'uomo ha rivelato la complessità delle malattie muscolari e l'analisi genetica di...

La seguente tecnica istologica per la preparazione di sezioni in paraffina e sezioni congelate dei muscoli toracici di drosophila permette un approccio efficace all'analisi della morfologia muscolare e dell'espressione proteica. Questo viene ottenuto immobilizzando innanzitutto gli animali in collari, quindi includendo il tessuto in paraffina o in mezzo OCT; i teli toracici inclusi vengono poi sezionati mediante microtomo.Infine, le sezioni vengono colorate per visualizzare le strutture del tessuto muscolare o rilevare diversi componenti molecolari dei muscoli. I campioni ottenuti, quando utilizzati in combinazione con metodi classici di colorazione istologica, coloranti fluorescenti o immunocolorazione, possono mostrare la morfologia del tessuto muscolare e la localizzazione di componenti specifici del muscolo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di recuperare sottili strati muscolari in una configurazione che si trova naturalmente all'interno dell'animale.Questo metodo può essere facilmente adattato ad altri sistemi, come l'addome cefalico di Drosophila. È stato sviluppato nel laboratorio di Helena Sheta, il laboratorio di espressione genica e segnalazione, e sarà dimostrato oggi da Maria Rinko. Conservare tutte le soluzioni per l'immersione dei collari in barattoli di vetro per colorazione fin dall'inizio.Preparare un fissativo carnoy fresco mescolando etanolo assoluto, cloroformio e acido acetico glaciale in proporzioni rispettivamente di sei a tre a uno. Creare una pila di fogli di alluminio, con tasche delle dimensioni corrette per i collari. Preparare anche le soluzioni di etanolo, metilato e paraffina in barattoli per colorazione.Ora posizionare i contenitori di benzoato di metile e paraffina in un incubatore impostato a 60-65 gradi Celsius. Inoltre, riscaldare ulteriore paraffina a 60-65 gradi Celsius. Per versare nelle sacche di alluminio, fissare il collare sotto il microscopio utilizzando del nastro adesivo in posizione verticale, in modo che il punto di ingresso per la mosca sia visibile.Anestetizzare le mosche utilizzando anidride carbonica oppure inducendo ipotermia con un blocco di ghiaccio. Fare attenzione a non congelare le mosche usando le pinzette. Prelevare singole mosche prendendole per le ali e posizionare ciascuna mosca nel collare in modo orientato, con la testa e il torace sopra le lame e l'addome al di sotto delle lame.Collocare da 10 a 20 moscerini in ciascun collare quando si analizzano diversi genotipi. Annotare il numero del collare e il genotipo corrispondente. Trasferire il collare nella soluzione di Carnoy e fissare il tessuto a quattro gradi Celsius durante la notte.Dopo la fissazione, disidratare il campione immergendo il collare in bagni di etanolo di concentrazioni crescenti per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Successivamente, incubare il collare in benzoato di metile e in soluzione di benzoato di metile più paraffina per 30 minuti ciascuno, quindi infiltrare il collare in due cambi di paraffina per 60 minuti ciascuno. A 60-65 gradi Celsius, trasferire rapidamente il collare in una tasca di alluminio.A questo punto, il collare deve essere posizionato nelle tasche di alluminio per facilitare l'orientamento longitudinale o trasversale delle sezioni. Successivamente, riempire le tasche con paraffina fusa in modo da permettere la solidificazione della paraffina. Lasciare le tasche di alluminio a temperatura ambiente per tutta la notte.Svolgere delicatamente i blocchi di paraffina asciutti con collare dalla pellicola e separare con cura il collare dal blocco di paraffina aiutandosi con un bisturi affilato. Rimuovere con attenzione l'eccesso di paraffina intorno al tessuto della mosca su un microtomo a rotazione. Tagliare il blocco di paraffina con sezioni spesse da sette a dieci micron.Lasciare il tessuto tagliato galleggiare piatto in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius. Infine, posizionare il tessuto sezionato su vetrini portaoggetti e farlo asciugare tutta la notte. Questi vetrini sono ora pronti per la colorazione con ematina ed eosina.Un'ora prima di iniziare l'esperimento, capovolgere il flacone del mezzo di inclusione criogenico e riporlo in un frigorifero a quattro gradi Celsius per raffreddarlo e ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria. Inoltre, preparare un congelatore a meno 60 gradi Celsius utilizzando etanolo e ghiaccio secco. Come per le sezioni in paraffina, immobilizzare le mosche in un collare, trasferire il collare con le mosche in una bustina di alluminio pre-rafreddata e riempire rapidamente con il composto criogenico OCT.Fare solidificare l'OCT. Svolgere con cura il blocco formato all'interno del refrigeratore. Separare delicatamente il collare dal blocco di inclusione e collocarlo a meno 20 gradi Celsius per almeno un giorno su un criomicrotomo; tagliare i muscoli congelati tra meno 15 e meno 18 gradi Celsius con uno spessore di sezione compreso tra 10 e 15 micron.Quindi posizionare i campioni su vetrini polarizzati. Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'ulteriore elaborazione. Le lacune lipidiche possono essere rilevate con la colorazione con olio rosso O su sezioni criostatiche.Utilizzando un protocollo adottato da Seber e Tum, ricordare che immediatamente prima della colorazione, le sezioni congelate devono essere fissate in formaldeide al 4% per 10 minuti dopo la fissazione. Lavare i vetrini con acqua due volte per cinque minuti ciascuna. Successivamente, equilibrare in propilene glicole per 10 minuti.Incubare ora per tre ore nell'olio. Colorare con rosso o a temperatura ambiente. Quindi lavare i campioni due volte per cinque minuti in glicole polipropilenico, seguito da 30 minuti in PBS; montare i campioni in glicerolo al 30%, colorare con ematossilina ed eosina in sezioni trasversali e longitudinali dei muscoli indiretti del volo per differenziare dimensioni e morfologia anomale da muscoli con struttura normale.Sezioni in paraffina possono essere anche colorate efficacemente con anticorpi, come indicato in questa sezione del tratto intestinale di drosophila illuminata per il marcatore dell'involucro nucleare. Laminina C e la colorazione nucleare DPI. Qui, sezioni trasversali del torace di drosophila sono colorate con anti-laminina C e DPI per mostrare un'immagine ingrandita di muscoli normali e deteriorati.In modo analogo, sezioni congelate longitudinali dei muscoli indiretti del volo possono essere colorate con anti distro, glicano muscolare, marcatore della sarcolemma e DPI quando vengono colorate con sezioni congelate trasversali del torace di drosophila al rosso O per evidenziare le goccioline lipidiche. Una combinazione di queste tecniche con altri metodi come la colorazione HNE e il rilevamento immunohistochimico offre un approccio potente per determinare la struttura del tessuto e la localizzazione delle proteine nei muscoli.

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Valutazione dell'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari muscolari longitudinali dorsali in Drosophila

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