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0 visualizzazioni • 4:43 min • April 30th, 2023
Un modello di mucosa esofagea umana comprende fibroblasti umani e cellule epiteliali cresciute su un'impalcatura esofagea di origine animale.
Per preparare un modello 3D di zattera di un esofago umano, inizia prendendo un'impalcatura esofagea sterile pretrattata per rimuovere le sue cellule native. Posizionare l'impalcatura con il lato sottomucoso rivolto verso l'alto in un pozzetto di coltura.
Quindi, posiziona un anello in acciaio inossidabile sull'impalcatura. All'interno dell'anello, seminare una sospensione di cellule di fibroblasti umani. Successivamente, erogare un mezzo di coltura fibroblastica attorno all'anello e incubare. L'anello confina i fibroblasti sulla superficie sottomucosa, facilitandone l'adesione.
Ora, rimuovi l'anello, aggiungi un nuovo terreno per immergere l'impalcatura e incuba. I fibroblasti proliferano per formare un foglio cellulare multistrato che secerne cofattori essenziali.
Quindi, capovolgere l'impalcatura, con la mucosa rivolta verso l'alto, e posizionare l'anello in acciaio inossidabile su di essa. Seminare una sospensione di cellule epiteliali umane all'interno dell'anello e aggiungere il terreno di coltura. Incubare per consentire alle cellule epiteliali confinate di aderire alla superficie della mucosa.
Quindi, rimuovere l'anello e aggiungere nuovi supporti. Incubare per diffondere i cofattori prodotti dai fibroblasti attraverso lo scaffold e promuovere la proliferazione delle cellule epiteliali.
Ora, utilizzando una griglia metallica, solleva l'impalcatura per esporre le cellule epiteliali proliferanti all'interfaccia aria-liquido. Ciò consente la completa maturazione della coltura in un modello umano-esofageo.
Iniziare la preparazione di un modello di mucosa esofagea reidratando pezzi di impalcatura suina che sono stati sterilizzati in glicerolo per almeno quattro mesi in 100 millilitri di PBS sterile per cinque agitazioni di 10 minuti, sostituendo il surnatante con PBS fresco per ogni lavaggio.
Dopo la quinta agitazione, testare la sterilità dell'impalcatura con un'incubazione notturna in 100 millilitri di DMEM a 37 gradi Celsius. La mattina successiva, trasferire gli scaffold in pozzetti individuali di una piastra a 6 pozzetti, con il lato sottomucoso rivolto verso l'alto. Quindi, posizionare un anello sterile in acciaio inossidabile per uso medico al centro di ciascuna impalcatura e utilizzare una pinza sterile per premere delicatamente sugli anelli per garantire un'adeguata tenuta con il tessuto.
Aggiungere 5 volte 10 al quinto fibroblasto esofageo umano in 0,2 millilitri di terreno fibroblativo al centro di ciascun anello. Quindi, inondare l'area intorno all'esterno dell'anello con almeno altri due millilitri di terreno fibroblastico e incubare gli scaffold in un incubatore per colture cellulari.
Trascorse 24 ore, rimuovere gli anelli e sostituire il terreno in ogni pozzetto con almeno 5 millilitri di terreno di coltura fresco per fibroblasti, avendo cura che gli scaffold siano totalmente immersi. Dopo una settimana, scartare il terreno e utilizzare una pinza per capovolgere gli scaffold, la superficie della mucosa rivolta verso l'alto. Riposizionare gli anelli sugli scaffold e quindi aggiungere 1 volta 10 alle seste cellule epiteliali in 0,2 millilitri di Composite Medium I al centro di ciascun anello.
Inondare l'area al di fuori dell'anello con circa 2 millilitri di Composite Medium I e rimettere i costrutti nell'incubatrice. Dopo 24 ore, rimuovere gli anelli e sostituire il terreno in ogni pozzetto con almeno 5 millilitri di Composite Medium I fresco, assicurandosi che gli scaffold siano completamente sommersi. Dopo altre 24 ore, sostituire il terreno con almeno 5 millilitri di Composite Medium II.
Il quarto giorno, posizionare griglie sterili in rete di acciaio inossidabile per uso medico nei pozzetti di una nuova piastra a 6 pozzetti e trasferire i costrutti sulle griglie, con la mucosa rivolta verso l'alto. Infine, aggiungere una quantità sufficiente di Composite Medium III per raggiungere la parte inferiore del composito lasciando la superficie esposta all'aria, assicurandosi che il campione sia mantenuto in un'interfaccia aria-liquido.