Azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando: una tecnica ad alto rendimento per identificare le proteine intracellulari leganti il secondo messaggero nucleotidico batterico

I batteri producono secondi messaggeri nucleotidici, NSM - molecole di segnalazione intracellulare - in risposta a stimoli appropriati. Queste molecole si legano alle proteine bersaglio e regolano le funzioni batteriche.

Per identificare queste proteine bersaglio utilizzando l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando, prelevare una piastra multipozzetto con lisato cellulare batterico contenente proteine solubili. Queste proteine derivano da diversi cloni batterici che esprimono singoli ORF - open reading frames - nel genoma, assicurando che ogni pozzetto abbia una proteina distinta.

Aggiungere una miscela di guanosina tetra- e penta-fosfati - NSM marcati con fosforo radioattivo. Queste molecole si legano alle proteine bersaglio nel lisato. Con uno strumento a spillo, raccogli una quantità uguale di liquido da ogni pozzetto. Posizionare l'utensile su una membrana di nitrocellulosa per depositare il liquido sotto forma di macchie.

Le proteine bersaglio si legano alla membrana attraverso interazioni non covalenti impedendone la diffusione. In questo modo si sequestrano gli NSM radiomarcati legati nel punto centrale di applicazione. Gli NSM liberi si diffondono rad