Azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando: una tecnica ad alto rendimento per identificare le proteine intracellulari leganti il secondo messaggero nucleotidico batterico

I batteri producono secondi messaggeri nucleotidici, NSM - molecole di segnalazione intracellulare - in risposta a stimoli appropriati. Queste molecole si legano alle proteine bersaglio e regolano le funzioni batteriche.

Per identificare queste proteine bersaglio utilizzando l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando, prelevare una piastra multipozzetto con lisato cellulare batterico contenente proteine solubili. Queste proteine derivano da diversi cloni batterici che esprimono singoli ORF - open reading frames - nel genoma, assicurando che ogni pozzetto abbia una proteina distinta.

Aggiungere una miscela di guanosina tetra- e penta-fosfati - NSM marcati con fosforo radioattivo. Queste molecole si legano alle proteine bersaglio nel lisato. Con uno strumento a spillo, raccogli una quantità uguale di liquido da ogni pozzetto. Posizionare l'utensile su una membrana di nitrocellulosa per depositare il liquido sotto forma di macchie.

Le proteine bersaglio si legano alla membrana attraverso interazioni non covalenti impedendone la diffusione. In questo modo si sequestrano gli NSM radiomarcati legati nel punto centrale di applicazione. Gli NSM liberi si diffondono radialmente con la fase liquida tramite azione capillare.

Utilizzare l'imaging al fosforo per rilevare i segnali radioattivi e ottenere un'immagine digitale delle macchie. Definisci i punti usando due cerchi. Quello esterno raffigura la periferia dei NSM diffusi. Il cerchio interno rappresenta i NSM sequestrati.

Calcola la frazione di legame - l'intensità della radioattività rilevata dal cerchio interno sulla radioattività totale del punto diffuso. Individuare i punti con frazioni di legame elevate per identificare i pozzetti con proteine bersaglio legate a NSM.

Per lo screening di DRaCALA delle proteine bersaglio, aggiungere 20 microlitri di lisati a cellule intere scongelati ai singoli pozzetti di una piastra per microtitolazione con fondo a V a 96 pozzetti e aggiungere 2,5 unità di endonucleasi Serratia marcescens a ciascun pozzetto. Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, mettere i lisati sul ghiaccio per 20 minuti.

Successivamente, mescolare volumi uguali di guanosina pentafosfato marcato con fosforo 32 e guanosina tetrafosfato e aggiungere 1x tampone di lisi #1 alla miscela per ottenere una soluzione di guanosina pentafosfato a quattro nanomolari.

Utilizzando una pipetta multicanale e puntali per pipette filtrati, mescolare 10 microlitri della miscela di guanosina pentafosfato con il lisato cellulare per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, lavare tre volte uno strumento a spillo 96X in una soluzione allo 0,01% di detergente non ionico per 30 secondi, seguito da 30 secondi di asciugatura su un tovagliolo di carta per lavaggio, prima di posizionare lo strumento a spillo nella piastra campione a 96 pozzetti. Dopo 30 secondi, sollevare lo strumento a spillo verso l'alto e posizionarlo verso il basso su una membrana di nitrocellulosa per 30 secondi.

Dopo cinque minuti di asciugatura, posizionare la membrana di nitrocellulosa nella cartella di plastica trasparente per la conservazione dell'esposizione allo schermo al fosforo e la visualizzazione mediante imaging al fosforo, come dimostrato.

Per quantificare e identificare le potenziali proteine bersaglio nel software di analisi associato all'imager al fosforo, aprire il file .gel delle piastre visualizzate.

Per definire i punti da analizzare, utilizzare la funzione "Analisi array" per impostare una griglia di 12 colonne per 8 righe. Per circoscrivere il bordo esterno delle macchie intere, definire dei grandi cerchi. Esporta il "Volumn+Sfondo" e l'"Area" dei grandi cerchi definiti in un foglio di calcolo, per circoscrivere i piccoli punti interni. Ridimensionare i cerchi definiti.

Esporta il "Volumn+Sfondo" e l'"Area" dei piccoli cerchi definiti e salva tutti i dati nel foglio di calcolo. Posiziona i cerchi in modo che si sovrappongano ai punti secondo necessità, ridimensionandoli leggermente più grandi dei punti effettivi.

Usa l'equazione per calcolare le frazioni di legame nel foglio di calcolo e tracciare i dati. Quindi, identificare le potenziali proteine leganti nei pozzetti che mostrano frazioni di legame elevate rispetto alla maggior parte degli altri pozzetti.