Saggio di ramificazione del glicogeno per misurare il grado di ramificazione del glicogeno

I polisaccaridi ramificati, come il glicogeno, comprendono residui di glucosio legati linearmente tramite legami alfa-1,4-glicosidici e nei rami tramite legami alfa-1,6-glicosidici.

Per determinare il grado di ramificazione nei polisaccaridi, iniziare con un reagente colorante acquoso contenente ioduro di potassio, iodio e cloruro di calcio. In condizioni acquose, lo ioduro di potassio e lo iodio producono ioni ioduro.

In provette da microcentrifuga separate, miscelare il reagente con polisaccaridi di strutture di ramificazione note e un campione di glicogeno con una struttura non caratterizzata.

I polisaccaridi adottano strutture elicoidali attraverso i loro legami alfa-1,4-glicosidici. Gli ioni ioduro si legano a questo nucleo elicoidale, formando catene lineari di poliioduro. Ciò si traduce nella formazione di complessi di trasferimento di carica tra i polisaccaridi e le catene di poliiodi, con conseguente colorazione di complessi polisaccaridi-ioduri.

I polisaccaridi non ramificati con catene poliiodure più lunghe sviluppano un colore blu, mentre i polisaccaridi ramificati con catene poliiodure più corte sviluppano complessi da giallastri a arancio-bruni. Il cloruro di calcio nel reagente intensifica il colore del complesso.

Trasferite il composto in cuvette usa e getta. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare lo spettro di assorbanza da 330 a 800 nanometri.

I complessi non ramificati di colore blu assorbono la luce a lunghezze d'onda più lunghe, dimostrando uno spostamento verso destra dei massimi di assorbanza. Al contrario, i complessi ramificati assorbono la luce a lunghezze d'onda più corte, con lo spostamento verso sinistra dei massimi di assorbanza che indica una maggiore ramificazione nella struttura.

I massimi di assorbanza del campione di glicogeno non caratterizzato a circa 450 nanometri confermano la sua struttura ramificata.

Per determinare la ramificazione del glicogeno, combinare 650 microlitri di stock di reagenti coloranti iodio/cloruro di calcio con 100 microlitri di acqua in una provetta da 1,5 millilitri e mescolare accuratamente la soluzione prima di trasferirla in una cuvetta monouso di metacrilato. Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro per condurre una corsa in modalità di scansione della lunghezza d'onda per raccogliere lo spettro di fondo da 330 a 800 nanometri.

In una provetta separata da 1,5 millilitri, unire 650 microlitri del reagente colorante iodio/cloruro di calcio con 50 microgrammi di glicogeno ostrica e portare il volume finale a 750 microlitri con acqua. Dopo aver miscelato accuratamente la miscela, trasferire la soluzione in una cuvetta di metacrilato monouso per raccogliere uno spettro di assorbimento da 330 a 800 nanometri.

Allo stesso modo, ottenere uno spettro di assorbimento con 50 microgrammi di amilopectina e 30 microgrammi di amilosio come descritto in precedenza.

Per ottenere un'indicazione della struttura ramificata di un campione di glicogeno non caratterizzato, combinare da 25 a 50 microgrammi di glicogeno con 650 microlitri del reagente colorante iodio/cloruro di calcio di lavoro e procedere come spiegato in precedenza per acquisire lo spettro di assorbimento.