5-metilcitosina dot blot per determinare l'entità della metilazione del DNA

La metilazione del DNA è una modificazione epigenetica che comporta l'aggiunta di un gruppo metilico alla base citosinica del DNA per formare la 5-metilcitosina. Questa modifica altera l'espressione genica.

Per quantificare la metilazione del DNA tramite dot-blot, prelevare campioni di DNA genomico derivati da condrociti umani a vari stadi di dedifferenziazione che mostrano diversi livelli di citosina metilata.

Trattare i campioni di DNA con idrossido di sodio, un alcali forte, e riscaldarli. Questo trattamento rompe i legami idrogeno tra i due filamenti di DNA, con conseguente denaturazione del DNA. Aggiungere acetato di ammonio per neutralizzare l'alcali, prevenendo un'eccessiva degradazione del DNA.

Prelevare una membrana di nylon e individuare i campioni di DNA denaturato sotto forma di punti. Il DNA caricato negativamente si lega alla membrana di nylon caricata positivamente tramite interazioni elettrostatiche, provocando il suo blotting sul supporto solido.

Trattare la membrana tamponata con un tampone bloccante per evitare il legame aspecifico. Quindi, aggiungere gli anticorpi anti-5-metilcitosina alla membrana e incubare. Questi anticorpi si legano esclusivamente alla citosina metilata sul DNA.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati e aggiungere anticorpi secondari coniugati con enzimi chemiluminescenti che si legano specificamente agli anticorpi primari.

Aggiungere un substrato chemiluminescente sulla membrana. L'enzima sull'anticorpo reagisce con il substrato per produrre chemiluminescenza, producendo punti di varie intensità.

Visualizzare la membrana e misurare l'intensità dei punti, che corrisponde all'entità della metilazione del DNA in ciascun campione.

Inizia questa procedura denaturando il DNA isolato in idrossido di sodio molare 0,1 per 10 minuti a 95 gradi Celsius. Neutralizzare il DNA con 1 molare di acetato di ammonio su ghiaccio, quindi diluire due volte con acqua distillata doppia.

La fase più critica del dot blot è l'individuazione dei campioni sulla membrana, farlo lentamente e con attenzione. Cerca di ridurre al minimo ogni area macchiata a 3 o 4 millimetri di diametro.

Utilizzando un puntale per pipetta a bocca stretta, individuare con cura 2 microlitri di DNA genomico diluito seriale su una membrana di nylon caricata positivamente al centro della griglia. Tamponare la membrana a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, bloccare i siti di legame degli anticorpi non specifici immergendo la membrana in BSA al 5% in TBST in una piastra di Petri da 10 centimetri per 1 ora a temperatura ambiente con una leggera agitazione.

Dopo 1 ora, lavare la membrana tre volte in TBST per 5 minuti ogni volta. Incubare la membrana con un anticorpo monoclonale di topo anti-5-metilcitosina in TBST a 4 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte in TBST per 5 minuti ogni volta.

Quindi, incubare con un anticorpo secondario - immunoglobulina G di pecora coniugata con perossidasi di rafano in TBST per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato la membrana in TBST come prima, aggiungere il substrato enzimatico alla membrana e incubare per 5-10 minuti. Infine, visualizzare il segnale dell'anticorpo secondario utilizzando un kit di chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore.