Isolamento magnetico della microglia dal cervello di un cucciolo di topo

Le microglia – i macrofagi residenti nel cervello – esprimono CD11b, un'integrina della superficie cellulare.

Per isolare la microglia dal cervello di un cucciolo di topo, prelevare frammenti di cervello in provette di dissociazione contenenti tampone con papaina, un enzima proteolitico, e desossiribonucleasi.

Posizionare i tubi su un dissociatore meccanico. Durante la corsa, il dissociatore rompe meccanicamente il tessuto.

La papaina digerisce la matrice extracellulare del tessuto, rilasciando le cellule, compresa la microglia, in sospensione. La desossiribonucleasi degrada il DNA libero in sospensione, impedendo un isolamento cellulare inefficiente.

centrifuga. Completare la dissociazione meccanica mediante pipettaggio. Trasferire la sospensione attraverso un filtro cellulare per rimuovere detriti e grumi cellulari e ottenere una popolazione omogenea di singole cellule.

Incubare con microsfere superparamagnetiche funzionalizzate con anticorpi anti-CD11b. Le microsfere si legano specificamente a CD11b sulle cellule, comprese le microglia.

Post-incubazione, centrifugazione. Rimuovere il surnatante contenente le perle non legate. Risospendere le celle nel buffer. Caricare su una colonna posta su un separatore magnetico. La colonna è composta da una matrice con perle ferromagnetiche.

Quando vengono posizionate sul separatore, le sfere all'interno della colonna amplificano il campo magnetico, trattenendo le cellule CD11b+ legate alle microsfere all'interno della colonna, mentre altre cellule fluiscono attraverso.

Estrarre dal separatore e utilizzare il tampone per eluire le cellule CD11b+ dalla colonna. Centrifugare la sospensione e risospendere le cellule CD11b+ in un terreno di coltura microgliale.

Le cellule isolate sono pronte per ulteriori analisi.

Preparare la miscela di dissociazione secondo questa tabella. Trasferire 12 pezzi di cervello in una provetta a C per un peso totale di 1,2 grammi per provetta di dissociazione. Quindi, posizionare i tubi C sul dissociatore con riscaldamento. Avviare il programma NTDK ottimizzato nel dissociatore. Centrifugare per 20 secondi. Completare la dissociazione meccanica pipettando tre volte.

Trasferire le cellule in quattro provette da 15 millilitri con filtri collegati. Sciacquare i filtri con 10 millilitri di HBSS con calcio e magnesio. Centrifugare per 10 minuti e rimuovere il surnatante con una pipetta da 10 millilitri. Aggiungere con cautela 10 millilitri di HBSS con calcio e magnesio e risospendere il pellet. Ancora una volta, centrifugare e rimuovere il surnatante.

Risospendere il pellet con 6 millilitri di tampone di selezione. Ripetere la centrifugazione e scartare il surnatante. Quindi, aggiungere 200 microlitri di soluzione di microsfere CD11b e incubare le provette per 15-20 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, risospendere il pellet con 6 millilitri di tampone di selezione. Ripetere la centrifugazione e risospendere il pellet con 8 millilitri di tampone di selezione.

Successivamente, seguire il programma POSSEL sul separatore per preparare otto colonne. Far passare le cellule attraverso la colonna aggiungendo 1 millilitro di sospensione cellulare alla volta. Con 1 millilitro di tampone di selezione, eluire le cellule CD11b positive su una piastra di eluizione sterile. Raggruppare le cellule in una provetta da 50 millilitri.

Centrifugare e risospendere il pellet con 10 millilitri di terreno di coltura microglia freddo. Contare le cellule CD11b positive. Risospendere le cellule in un terreno di microglia freddo per ottenere una concentrazione finale di 650.000-700.000 cellule per millilitro.