Isolamento e coltura dei neuroni dei granuli cerebellari primari di topo

Prendi un cervello di cucciolo di topo appena raccolto.

Separare il cervelletto e rimuovere il suo strato membranoso.

Dal lato ventrale, rimuovere la rete di vasi sanguigni.

Tagliare il cervelletto in frammenti e trasferirli in una provetta contenente tampone.

Centrifugare ed eliminare il surnatante contenente detriti.

Aggiungi tripsina, un enzima proteolitico, per digerire la matrice extracellulare del tessuto e sciogliere le cellule.

Aggiungere un tampone contenente inibitore della tripsina e DNasi.

L'inibitore blocca l'attività della tripsina mentre la DNasi degrada il DNA contaminante.

Dissociare meccanicamente il tessuto per formare una sospensione cellulare, compresi i neuroni dei granuli cerebellari e le cellule non neuronali o gliali.

Trasferire la sospensione cellulare in un tubo.

Aggiungi buffer. Centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in terreni e piastrle su piastre di coltura rivestite con poli-D-lisina.

Le celle si attaccano alle superfici rivestite.

Aggiungere un antimetabolita per eliminare le cellule gliali proliferanti e generare una coltura pura di neuroni granulari cerebellari.

Per isolare il cervelletto, posizionare il cervello nella soluzione di dissezione integrata con solfato di magnesio e mantenere la soluzione e il cervello in ghiaccio.

Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere le meningi usando una pinza fine. Quindi, sezionare il cervelletto dal cervello in una soluzione di dissezione integrata con solfato di magnesio. Questo aiuta a staccare le meningi rimanenti e permette di andare tra gli strati per pulire le pieghe cerebellari.

La presenza di meningi in coltura neuronale provoca cellule malsane e alla morte cellulare. Pertanto, è importante garantire la completa rimozione delle meningi prima di procedere con la coltura.

Successivamente, gira il cervelletto sul lato ventrale e assicurati la rimozione del plesso coroideo. Successivamente, raccogli il cervelletto in un piatto da 35 millimetri contenente 1 millilitro di soluzione di dissezione integrata con solfato di magnesio. Tagliare i tessuti in piccoli pezzi e trasferirli in una provetta da 50 millilitri contenente 30 millilitri di soluzione di dissezione tamponata con solfato di magnesio.

In questa fase, centrifugare la provetta da 50 millilitri contenente il tessuto cerebrale tritato per cinque minuti a 644 volte g e 4 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il surnatante e aggiungere 10 millilitri di soluzione di dissezione di tripsina. Quindi, scuotere il tavolo ad alta velocità per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Aggiungere 10 millilitri di soluzione di inibitore della tripsina-I al tubo e agitare delicatamente per due minuti. Successivamente, centrifugare la provetta per cinque minuti a 644 volte g e 4 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere 2 millilitri di soluzione inibitrice della tripsina-II prima di trasferirla in una provetta da 15 millilitri.

Quindi, triturare il tessuto nella provetta da 15 millilitri fino a quando la soluzione diventa torbida. Lasciate riposare per cinque minuti. Quindi rimuovere il surnatante limpido e trasferirlo in una nuova provetta contenente 1 millilitro di soluzione di dissezione integrata con cloruro di calcio.

Aggiungere altri 2 millilitri di soluzione inibitrice della tripsina-II sul fondo del tubo contenente il pellet. Trituratela nuovamente e lasciatela riposare per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungerlo al tubo contenente il surnatante del passaggio precedente. Ripetere questo processo fino a quando la maggior parte del tessuto non è dissociata meccanicamente.

Aggiungere 0,3 millilitri di soluzione di dissezione integrata con cloruro di calcio alla raccolta del surnatante per ogni millilitro di surnatante. Mescolare il contenuto della provetta e poi centrifugare per cinque minuti a 644 volte g a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il surnatante. Aggiungere 10 millilitri di terreno fresco al pellet e mescolare.

Quindi, contare le cellule vive e diluirle a una concentrazione di 1,5 x 10⁶ cellule per millilitro. Placcare le celle sulle piastre di poli-D-lisina precedentemente preparate. Per le piastre a quattro pozzetti, posizionare 0,5 millilitri di campione, ottenendo 7,5 x 10⁵ cellule per pozzetto. Per piatti da 35 millimetri, piastra 4 millilitri di campione, ottenendo 6 x 10⁶ celle per piastra. Per i vetrini, piastra da 0,5 ml, somministrando 7,5 x 10⁵ celle per pozzetto.

Dopo 24 ore, aggiungere AraC due piastre per ridurre la contaminazione gliale. Se le cellule devono essere mantenute per sette-otto giorni, ripetere questo trattamento il giorno 3 e mantenere le colture in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 gradi Celsius.