Generazione dell'espiantazione del ganglio della radice dorsale e della coltura cellulare dissociata

Inizia con il ganglio della radice dorsale o i tessuti DRG in un terreno privo di siero. Il tessuto DRG contiene neuroni sensoriali e cellule gliali satelliti incorporate nella matrice extracellulare, ECM.

Seminali su un piatto di coltura rivestito con una miscela proteica gelatinosa per migliorare l'adesione dei tessuti.

Nel tempo, le cellule gliali rilasciano fattori di crescita neurotrofici che consentono estensioni neuronali, stabilendo una coltura di espianti DRG.

Per sviluppare una coltura cellulare dissociata, prendere questi espianti di DRG in una provetta. Trattali con collagenasi per degradare la ECM e poi con tripsina, che interrompe le connessioni cellulari, rilasciando neuroni e cellule gliali.

Aggiungere un terreno arricchito con siero per fermare la reazione enzimatica.

Pipettare ripetutamente il contenuto per creare una sospensione a cellula singola e filtrarla per rimuovere i detriti.

Centrifugare questa sospensione cellulare e rimuovere il surnatante contenente l'enzima.

Risospendere le cellule in un mezzo neurobasale e trasferirle su una piastra rivestita di laminina.

Le cellule gliali satelliti e i neuroni sensoriali aderiscono alla piastra rivestita di laminina, stabilendo una coltura cellulare dissociata.

Trasferire ogni DRG in una capsula di Petri di vetro asciutta. Sotto un microscopio operatorio, pulire e tagliare le fibre in eccesso e il tessuto connettivo ancora attaccati al DRG utilizzando una lama. Il DRG è facilmente identificabile come una struttura rigonfia e trasparente lungo il nervo spinale bianco e i vasi sanguigni si trovano spesso intorno al DRG.

Successivamente, posizionare il pulito in DRG in una nuova capsula di Petri contenente terreni ghiacciati e privi di siero. Diluire la miscela proteica gelatinosa in un terreno ghiacciato e privo di siero in un rapporto 1 a 1. Quindi, piastrate il DRG ex vivo nelle piastre a 12 pozzetti, prerivestite con 10 o 20 microlitri di miscela proteica gelatinosa, e mantentele a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti.

Ora, aggiungere delicatamente da 1,5 a 2 millilitri di terreno privo di siero al sistema di coltura per coprire l'intero espiante e mantenere gli espianti alle condizioni di coltura. Cambiare il mezzo di crescita DRG ogni 72 ore. e lasciare che il DRG cresca per tutto il tempo necessario.

Questo è un passaggio critico poiché il DRG è ancorato alla lastra di vetro utilizzando la miscela di proteine gelatinose. Pertanto, il tempo di polimerizzazione e le competenze di pipettaggio sono fondamentali per evitare il galleggiamento.

In questa procedura, posizionare tutto il DRG raccolto in una provetta sterile da 1,5 millilitri con terreno F12 contenente collagenasi IV e incubarlo a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Successivamente, sostituire il terreno fresco contenente collagenasi IV e incubare il campione per altri 45 minuti. Quindi, trattare gli espianti con 2 millilitri di terreno F12 contenente lo 0,025% di tripsina a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Immediatamente dopo il trattamento con collagenasi IV, incubarli con 2 millilitri di terreno F12 contenente siero fetale bovino a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, lavare gli espianti tre volte con 2 millilitri di terreno F12 e procedere alla dissociazione meccanica con una pipetta di vetro, fino a quando il terreno diventa torbido.

Successivamente, filtrare la coltura cellulare dissociata attraverso un filtro da 0,22 micrometri per rimuovere eventuali impurità e tessuto connettivo in eccesso. Quindi, centrifugare il lisato cellulare filtrato per due minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di terreno neuro-basale. Posizionare le cellule dissociate su vetrini rivestiti di laminina alla densità cellulare preferita.