Una tecnica per la raccolta e la dissociazione dei gangli della radice dorsale per le colture neuronali

Prendi una sezione della colonna vertebrale di un ratto e dividila per rimuovere il midollo spinale.

Staccare i gangli della radice dorsale, o DRG, un gruppo di neuroni circondati da cellule gliali satelliti, o SGC.

Posizionare i DRG in un terreno di coltura. Rimuovere le radici nervose per ridurre la contaminazione da SGC.

Trattare con collagenasi per degradare la matrice tissutale e lavare per rimuovere gli enzimi.

Introdurre la tripsina per interrompere le connessioni intercellulari. Aggiungere un siero contenente proteine che disattivano la tripsina.

Aggiungere il terreno di coltura e dissociare meccanicamente il tessuto. Filtrare la sospensione per isolare le singole cellule e centrifugare per rimuovere i detriti tissutali.

Risospendere le cellule per sovrapporle su un mezzo di gradiente di densità e centrifugare.

I neuroni con una densità più elevata si depositano sul fondo, facilitando la separazione degli SGC.

Risospendere i neuroni in un terreno di coltura. Trasferirli su un pozzetto rivestito di substrato di coltura, consentendo l'adesione delle cellule.

Integrare con fattori di crescita nervosi per la sopravvivenza neuronale.

Per ottenere i neuroni DRG dopo aver prelevato il midollo spinale, iniziare rimuovendo eventuali parti dorsali e poi, utilizzare forbici chirurgiche sterili e affilate per dividere la colonna vertebrale a metà lungo l'asse longitudinale, esponendo il tessuto midollare. Tagliare la colonna vertebrale in due segmenti più piccoli al di sotto del livello della gabbia toracica, quindi utilizzare una pinza fine per rimuovere delicatamente tutto il tessuto midollare, facendo attenzione a non tirare e rimuovere le radici DRG, che appaiono come filamenti bianchi che escono direttamente dai canali.

Una volta rimosso tutto il tessuto centrale, utilizzare una pinza molto sottile per estrarre l'intera radice DRG, raggiungendo in profondità i canali vertebrali e facendo attenzione a non danneggiare le radici dei gangli. Mettere il DRG in una capsula di Petri da 60 millimetri quadrati contenente da 3 a 4 millilitri di terreno F-12 di Ham, integrata con antibiotici. Quindi, sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una pinza sterile e un bisturi per eliminare le radici nervose in eccesso che circondano i gangli per ridurre la contaminazione delle cellule satelliti.

Successivamente, trasferire il DRG in una capsula di Petri da 35 millimetri quadrati contenente 1,8 millilitri di terreno F-12 fresco e aggiungere 200 microlitri di soluzione madre di collagenasi di tipo 4. Incubare il DRG per un'ora, quindi aspirare accuratamente il terreno con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non aspirare o danneggiare il DRG.

Ripetere il passaggio della collagenasi e lavare il DRG con un mezzo F-12. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 1,8 millilitri di terreno F12 e 200 microlitri di tripsina alle cellule, rimuovendo la tripsina e aggiungendo 1 millilitro di terreno integrato con 500 microlitri di FBS per arrestare la reazione enzimatica. Quindi, aspirare il terreno e lavare delicatamente il DRG con F-12 tre volte per rimuovere tutte le tracce del siero.

Ora, alimenta le cellule con 2 millilitri di terreno F-12 fresco e usa una pipetta di vetro per trasferire con cura la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri. Pipettare su e giù da 8 a 10 volte per dissociare delicatamente i neuroni, quindi lasciare che il pellet si accumuli sul fondo del tubo. Quando il pellet si è depositato, trasferire il surnatante in un nuovo tubo e aggiungere 2 millilitri di terreno F12 fresco al pellet, ripetendo la dissociazione meccanica e il trasferimento del mezzo fino a quando la sospensione diventa omogenea.

Quindi, triturare la sospensione cellulare tre o quattro volte, seguita dalla filtrazione della sospensione omogeneizzata risultante attraverso un filtro cellulare da 100 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri. Centrifugare le cellule in una provetta da 15 millilitri. Mentre girano, pipettare lentamente il 15% di albumina sierica bovina appena preparata all'interno di una provetta da 15 millilitri tenuta a un angolo di 45 gradi per creare una scia proteica graduale utilizzando i numeri sulla provetta come riferimento per la traccia di formazione.

Quindi, aspirare il surnatante dalle cellule, risparmiando gli ultimi 500 microlitri per risospendere il pellet, ed erogare lentamente le cellule lungo la scia proteica nel nuovo tubo. Dopo aver fatto girare nuovamente le cellule, risospendere il pellet in 1 millilitro di terreno BS modificato e seminare le cellule in un piccolo volume di terreno in una piastra a 24 pozzetti per due ore. Quando le cellule si sono attaccate, aggiungere un terreno BS fresco integrato con 50 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita nervoso.