Monitoraggio basato sulla fluorescenza dello stress mitocondriale negli astrociti

Iniziare con una coltura di astrociti trasdotta per esprimere una proteina mito-timer localizzata nei loro mitocondri.

Mito-timer agisce come un biosensore mitocondriale, emettendo fluorescenza verde nei mitocondri sani e passando alla fluorescenza rossa in quelli stressati o danneggiati.

Selezionare al microscopio astrociti grandi e isolati per l'imaging.

Utilizzando diverse lunghezze d'onda di eccitazione, acquisisci immagini per la fluorescenza verde e rossa.

Per analizzare le immagini, seleziona i fotogrammi per entrambi i canali rosso e verde, quindi scegli Unisci canali.

Applica la correzione automatica dell'ombreggiatura ed esegui l'algoritmo di miglioramento dell'immagine per migliorare la nitidezza dell'immagine.

Selezionare i parametri morfologici desiderati dei mitocondri per l'analisi.

Utilizzando la scheda Intensità media, misurare le intensità medie della fluorescenza rossa e verde.

Calcola il rapporto tra l'intensità rossa e quella verde, che indica la salute mitocondriale complessiva dell'astrocita.

Valutare il sistema mitocondriale astrocitico, almeno tre-cinque giorni dopo le infezioni lentivirali con LV-G1-MitoTimer. Selezionare cinque astrociti per pozzetto con una rete mitocondriale che esprima livelli sufficienti di LV-G1-MitoTimer utilizzando un ingrandimento di 40 volte, facendo attenzione a selezionare gli astrociti il più piatti e grandi possibile e non situati in gruppi di cellule. Quindi, acquisisci immagini a fluorescenza utilizzando l'eccitazione sequenziale a 490 nanometri per il canale verde e 550 nanometri per il canale rosso con segnali fluorescenti verdi e rossi e utilizzando un ingrandimento di 150 volte per ciascuna coordinata.

Selezionare il primo fotogramma per i canali rosso e verde per ogni sequenza di immagini facendo clic su Elaborazione ND e Seleziona fotogramma. Quindi, unisci i canali rosso e verde selezionando Conversioni e Unisci canale. Per correggere l'ombreggiatura dell'immagine, selezionare Pre-elaborazione e quindi Correzione automatica dell'ombreggiatura. Applicare l'algoritmo della palla rotante selezionando Pre-elaborazione e Palla rotante.

Per generare maschere binarie per ogni mitocondrio, selezionare Segmentazione e Soglia. Rimuovere tutti gli oggetti troncati dal bordo selezionando Elaborazione binaria e Toccando il bordo. Selezionare Misurazione, quindi Area oggetto, Diametro EQ, Lunghezza, Larghezza, Rugosità, Circolarità o Allungamento per misurare rispettivamente l'area della superficie, il diametro, la lunghezza, la larghezza, la rugosità, la circolarità o l'allungamento.

Componi un gruppo con queste misurazioni e rinominalo come dati morfo. Selezionare quindi Misurazione, quindi selezionare Intensità media per misurare le intensità medie del verde e del rosso e Rapporto per misurare il rapporto tra rosso e verde.

A questo punto, componi un gruppo con queste misurazioni e rinominalo come dati di rapporto. Infine, esportare la tabella in un file CSV selezionando Riferimento e Tabella in CSV e quindi salvare lo script di analisi GA 3 selezionando Salva con nome.