Studio dell'effetto dei pesticidi sui neuroni di Caenorhabditis elegans

Iniziare con una piastra di agar contenente Caenorhabditis elegans transgenico che esprime proteine fluorescenti verdi o GFP nei loro neuroni.

Aggiungere acqua sterile alla piastra, agitarla per sollevare i vermi e trasferirli in un tubo.

Lasciare che i vermi si depositino, quindi rimuovere l'acqua in eccesso e rimetterli in sospensione.

Trasferire i vermi risospesi su una piastra rivestita di pesticidi e su una piastra di controllo senza pesticidi, quindi incubare.

Sulla base delle loro azioni, il pesticida danneggia specificamente alcuni neuroni e provoca gonfiore neuronale, diminuendo l'espressione della GFP.

Trasferisci i vermi su un tampone di agarosio che contiene un agente anestetico, quindi posiziona un vetrino coprioggetti.

Montare il vetrino su un microscopio fluorescente. Innanzitutto, visualizza i vermi utilizzando la modalità a contrasto di fase, quindi passa alla modalità a fluorescenza.

Nei vermi trattati con pesticidi, i neuroni mostrano una fluorescenza ridotta, soma gonfi e lacune nei processi neuronali, indicando effetti neurodegenerativi.

Durante il controllo, i neuroni sani mostrano soma intatto con fluorescenza brillante.

Utilizzando una micropipetta, posizionare 1 millilitro di acqua sterile sulla piastra dei nematodi. Quindi, agita l'acqua per sollevare i nematodi. Quindi, rimuovere il liquido con i nematodi in un tubo per microfughe da 1,5 millilitri. Dopo 10 minuti, poiché i nematodi si depositano per gravità, rimuovere con cura almeno 500 microlitri di acqua e gettarli.

Quindi, risospendere i nematodi e, utilizzando una punta di pipetta gialla tagliata, rimuovere da 50 a 100 microlitri di vermi sospesi su ciascuna piastra di trattamento, assicurandosi che ogni piastra contenga almeno 10 vermi adulti. Preparare due vetrini posizionando un pezzo di nastro adesivo su un solo lato del vetrino per formare un tampone di spessore uniforme.

Quindi, posizionare uno scivolo pulito e inutilizzato tra di loro sul piano di lavoro. Posizionare una goccia da 10 microlitri di agarosio fuso al centro del vetrino utilizzando un micropipettatore. Quindi, appiattire la goccia posizionando un altro vetrino pulito sulla parte superiore perpendicolare al vetrino con la goccia e applicare pressione in modo che la goccia di agarosio formi lo spessore del nastro di etichettatura.

Successivamente, applicare una pressione costante per separare le due diapositive. Quindi, appoggiare il vetrino con l'agar rivolto verso l'alto sul piano di lavoro e lasciarlo asciugare per uno o due minuti prima dell'uso. Per aggiungere nematodi al vetrino preparato con il tampone di agarosio, aggiungere una goccia d'acqua da 5 microlitri contenente 1 molare di azoturo di sodio al tampone di agar, che anestetizzerà i vermi e li mobilizzerà.

Quindi, trasferire almeno 10 nematodi per vetrino di trattamento sulla gocciolina utilizzando un plettro per vermi, che deve essere sterilizzato prima e dopo il trasferimento dei nematodi. Quindi, aggiungi un vetrino coprioggetti usando una pinza posizionandolo ad angolo e abbassandolo lentamente.

Successivamente, posizionare la montatura bagnata preparata su un microscopio fluorescente per osservare i vermi, prima con un ingrandimento e un contrasto di fase 10x, poi con un ingrandimento inferiore a 40x con contrasto di fase e illuminazione fluorescente.

Posizionare una montatura bagnata preparata alla volta sul tavolino del microscopio e fissarla in posizione utilizzando le clip del tavolino del microscopio. Quindi, inizia a visualizzare le montature bagnate con l'obiettivo con l'ingrandimento più basso, che in genere è 10x, e usa un campo chiaro o un contrasto di fase per visualizzare e mettere a fuoco i nematodi.

Una volta che un nematode si trova nel campo visivo, mettere a fuoco su di esso utilizzando la manopola di messa a fuoco fine sul microscopio. Quindi, passa l'illuminazione alla fluorescenza ruotando la ghiera e dirigendo la luce verso la fotocamera per acquisire le immagini digitali.

Quindi, regola l'illuminazione utilizzando il software di imaging in modo che i neuroni siano illuminati intensamente, ma non eccessivamente saturi. Ad un certo punto, ottenere un'immagine separata di un righello con lo stesso ingrandimento delle immagini della cella per fornire una scala di ingrandimento per la loro figura.