Stimolazione dei neuroni sensoriali del ganglio della radice dorsale utilizzando un agonista del recettore dei neuropeptidi

Prendi una piastra a più pozzetti contenente neuroni sensoriali del ganglio della radice dorsale di ratto trasfettati.

I neuroni del pozzetto del test mostrano una ridotta espressione del recettore dei neuropeptidi, mentre i neuroni del pozzetto di controllo mostrano livelli fisiologici di espressione del recettore dei neuropeptidi.

Sostituire il terreno con terreno privo di siero per fornire un ambiente controllato per una risposta di stimolazione accurata.

Aggiungere un agonista del recettore dei neuropeptidi ai pozzetti e mescolare. Incubare la piastra.

Nel pozzetto di controllo, l'agonista del recettore dei neuropeptidi si lega ai recettori bersaglio, innescando una cascata di segnalazione intracellulare che rilascia neurotrasmettitori.

Tuttavia, nei pozzetti di prova, la ridotta espressione del recettore dei neuropeptidi limita il legame con l'agonista, portando a una diminuzione del rilascio di neurotrasmettitori rispetto al controllo.

Dopo l'incubazione, raccogliere il terreno dai pozzetti e centrifugare.

Trasferire il surnatante in provette e utilizzare un test immunologico adatto per misurare i livelli di neurotrasmettitori. Il campione di controllo mostra un rilascio di neurotrasmettitore più elevato rispetto al campione di prova dopo la stimolazione dell'agonista del neurorecettore.

Il giorno 6, dopo la piastratura e 72 ore dopo la trasfezione del siRNA, cambiare il terreno di coltura con 200 microlitri di terreno privo di siero. Dopo un'incubazione di 30 minuti, aggiungere 1 microlitro di sostanza chimica di stimolazione e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Dopo l'incubazione per il periodo richiesto, raccogliere il terreno di coltura dal piatto di coltura e centrifugare a 5.000 volte g per 5 minuti a 4 gradi Celsius per rimuovere eventuali impurità in sospensione. Raccogliere il surnatante dalla centrifugazione e diluirlo con soluzione fisiologica tamponata con fosfato secondo necessità.