Induzione di lesioni cerebrali traumatiche penetranti nelle mosche adulte di Drosophila

Prendete le mosche Drosophila adulte appena emerse e geneticamente modificate.

I corpi dei funghi nel cervello della mosca contengono neuroni che esprimono proteine fluorescenti verdi.

I corpi a fungo sono strutture contenenti reti neuronali complesse essenziali per l'apprendimento e la memoria.

Anestetizzare le mosche su un tampone di anidride carbonica.

Sotto uno stereomicroscopio dotato dei filtri necessari, visualizzare i corpi dei funghi che esprimono la fluorescenza verde.

Prendi uno spillo Minutien igienizzato e spingilo attraverso la capsula della testa nel corpo del fungo.

Ciò provoca danni ai neuroni del corpo a fungo e interrompe le reti neuronali, infliggendo lesioni cerebrali traumatiche penetranti.

Quindi, rimuovi delicatamente il perno dalla mosca.

Metti le mosche ferite in una fiala con del cibo e lasciale riprendersi per ulteriori studi.

Dopo aver anestetizzato le mosche su un tampone di anidride carbonica, selezionare le giovani mosche maschi F1 appena chiuse entro sei ore dall'eclosione e metterle in fiale pulite contenenti cibo con 40 mosche o meno per fiala. Successivamente, disinfetta i perni da minuzia posizionando circa 100 spilli in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri riempita con etanolo al 70% per cinque minuti. Quindi, igienizzare il tampone di anidride carbonica con il pennello spruzzando etanolo al 70% e asciugandolo con un panno pulito e privo di lanugine.

Una volta che gli strumenti sono puliti e asciutti, trasferire 40 o meno maschi F1 ordinati sul tampone pulito e separarli in due gruppi. Un gruppo fungerà da mosche illese di controllo e il secondo gruppo sperimentale sarà sottoposto a lesione cerebrale traumatica penetrante. Quindi, usando una pinza, estrarre quattro o cinque nuovi perni minuziosi dalla provetta della microcentrifuga e posizionarli vicino al bordo del tampone di anidride carbonica. Quindi, sotto il cannocchiale da dissezione, scegli uno spillo dritto con una punta acuminata. Riutilizzare i perni affilati e posizionare i perni danneggiati o smussati in un tubo separato contenente il 70% di etanolo per uno smaltimento sicuro.

Successivamente, per i moscerini con genotipo incrociato standard, accendere la lampada LED per stereomicroscopio dotata di filtri di eccitazione ed emissione appropriati per la proteina fluorescente verde, che consente l'eccitazione a 440-460 nanometri e consente la visualizzazione a 500-560 nanometri. Quindi, scegli una mosca dal gruppo sperimentale e posiziona la mosca in modo tale che lo sperimentatore abbia una vista dorsale della capsula della testa con la testa della mosca a destra. Usando una pinza, raccogli e tieni premuto il perno da minuzia selezionato in una mano e il pennello nell'altra mano. Quindi, posiziona la spazzola all'interno del torace dorsale e spingi delicatamente verso il basso per stabilizzare la mosca.

Punta la punta della spilla minuziosa verso i corpi dei funghi, i corpi cellulari sul lato destro della testa e penetra nella capsula della testa. Se si utilizzano punti di riferimento, mirare alla cuticola della testa dorsale tra gli ocelli e il bordo dorsale dell'occhio. Dopo aver completato l'infortunio, usa il pennello per spingere delicatamente la testa fuori dal perno dei minuti. Se si utilizza il cervello per il sequenziamento dell'RNA o la qRT-PCR, fare una seconda lesione sul lato sinistro della testa. Una volta che tutte le mosche sperimentali sono state ferite, posizionare le mosche di controllo e quelle ferite in fiale separate ed etichettate contenenti cibo.