Dissezione di cuore in larvale, Zebrafish giovanile e degli adulti, Danio rerio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rimuovere il cuore dal pesce zebra. Ciò si ottiene raccogliendo e fissando prima il pesce zebra. Successivamente, la cavità corporea viene aperta per visualizzare il cuore.

Quindi il cuore viene rimosso e ripulito dal tessuto non cardiaco. Infine, viene fotografato il cuore. In definitiva, la morfologia del cuore nel tempo può essere vista attraverso la microscopia, il sezionamento e la fotografia.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale come chiave per la dissezione. Gli Sta sono difficili da imparare perché i pesci zebra sono piccoli e i tessuti non sono di colore distinto e possono essere difficili da identificare Per generare pesci zebra dalle larve fino agli stadi adulti. Per questi esperimenti, eseguire accoppiamenti individuali di pere o di gruppo con pesci adulti.

Pulisci gli embrioni e conservali in un'incubatrice a 28 gradi Celsius. A cinque giorni dalla fecondazione, separare i pesci in vasche con una densità di 10-15 pesci e metterli nella struttura ittica. Togliete il pesce dalla sua vasca all'età appropriata e mettetelo in 0,2% di Trica per anestetizzarlo.

Metti il pesce anestetizzato in acqua ghiacciata per 15 minuti per l'eutanasia. Nel frattempo, aggiungere il 4% di formaldeide o PFA in un XPBS a un piatto. Incubare il pesce raccolto nel 4% di PFA per una o due ore a temperatura ambiente, quindi per una notte a quattro gradi Celsius in una capsula di Petri avvolta in perfil.

Questo mantiene il pesce piatto e rende la dissezione molto più facile dopo la fissazione. Risciacquare due volte in PBS con lo 0,1% di interpolazione o il pesce PBT può essere conservato in PBT a quattro gradi Celsius per un massimo di 10 giorni. Mettere un singolo pesce in una capsula di Petri, riempita a metà con PBS fresco e adagiarla sul lato destro.

Misura la lunghezza del pesce dal muso alla base della coda, escluse le pinne caudali utilizzando un calibro digitale millimetrico. Questa è la lunghezza standard o sl. Assegnare a ciascun pesce una combinazione di lettere numeriche per consentire di tracciare un singolo pesce e il cuore sezionato risultante per un'analisi successiva.

Inserisci tutti i dati, comprese tutte le misurazioni, in un foglio di calcolo e organizzati in base a queste etichette prima della dissezione. Etichettare le strisce di provette PCR con il numero di tracciabilità assegnato e riempire le provette con PVT o altra soluzione appropriata per ulteriori analisi. Orientare il sito ventrale del pesce verso l'alto in una capsula di Petri mentre si stabilizza il corpo con una pinza, tenendo la testa tra gli occhi e le branchie per pesci di lunghezza standard inferiore a 12 millimetri.

Utilizzando una pinza affilata o un microago in un portaspilli. Rimuovi i muscoli pettorali e le pinne dal corpo per rivelare il cuore. Il movimento costante della pinza durante la dissezione può causare correnti nel PPT che spostano il pesce.

Questo è particolarmente problematico per i pesci più piccoli. Pertanto, è necessario utilizzare un microago per rimuovere i muscoli pettorali e la pinna e aprire la cavità del corpo. Usa le pinze per estrarre delicatamente il cuore dalla cavità da sotto l'atrio.

Se il pesce contiene un marcatore cardiaco fluorescente, utilizzare un endoscopio fluorescente per la dissezione e verificare la rimozione del cuore mediante fluorescenza. Una volta rimosso il cuore dalla cavità, utilizzare la pinza per tenere il cuore e un microago per rimuovere il tessuto non cardiaco in eccesso e il rivestimento epicardico dall'esterno del cuore. Per pesci di lunghezza standard superiore a 12 millimetri.

Usando le micro forbici con manico a molla, fai tre incisioni. Per prima cosa, fai un taglio trasversale attraverso le branchie. In secondo luogo, fai un altro taglio trasversale sul ventre anteriore.

E terzo, fai un taglio sagittale sul lato ventrale collegando entrambi i tagli trasversali. Usando una pinza affilata, rimuovi i muscoli pettorali e le pinne dal corpo per aprire la cavità corporea e rivelare il tessuto argenteo del pericardio. Rimuovete questo tessuto pericardico e il cuore diventerà visibile.

Usa le micro forbici per tagliare l'arteria collegata al bulbo arterioso situato superiormente al cuore. Una volta tagliata questa arteria, posiziona le punte delle pinze sotto l'atrio e usa le pinze per estrarre il cuore dalla cavità. Se c'è del tessuto in più che viene fornito con il cuore, va bene perché può essere rimosso in seguito.

In alternativa, in alcuni pesci, è possibile rimuovere il cuore tirando delicatamente fuori il bulbo e il resto del cuore seguirà. Fai attenzione alla posizione dell'atrio se usi la tecnica alternativa in quanto può essere facilmente danneggiato. Se c'è del tessuto in più che viene fornito con il cuore, questo va bene e può essere eliminato dopo.

Una volta che il cuore è stato rimosso dalla cavità, usa le due pinze per tenere il cuore e rimuovere il tessuto in eccesso o un paio di pinze per tenere il cuore e un microago per rimuovere il tessuto non cardiaco in eccesso. Per fotografare il cuore del pesce zebra, prepara una capsula di Petri per agar nutriente da 23 grammi per litro e copri l'agar solidificato con PBS. Usa la pinza per creare un pozzetto nell'agar che consenta al cuore di adattarsi nell'orientamento corretto.

Rimuovere il cuore dalla provetta per PCR tenendo la punta del bulbo. Con il forcipe saldamente. Mettere il cuore nella capsula di agar.

Orientare il cuore nell'agar da fotografare. Il campione può essere ruotato dopo ogni immagine in tutti gli orientamenti possibili. Usa l'alto, la luce e tempi di esposizione brevi per fotografare i cuori.

Effettuare le regolazioni della qualità della luce utilizzando l'esposizione necessaria per ottenere la migliore fotografia. Un esempio di un cuore pulito ben sezionato è mostrato qui. Ogni cuore avrà alcune differenze nella morfologia complessiva, ma il cuore dovrebbe essere completo e contenente un atrio ventricolare intatto e un'arteriosi bulbosa dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo cardiaco del pesce zebra per esplorare la maturazione cardiaca in varie fasi dello sviluppo del pesce zebra.