In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di inibire o abbattere l'espressione di una proteina specifica nella retina adulta del pesce zebra. Ciò si ottiene rimuovendo prima la cornea esterna dell'occhio di pesce. Successivamente, viene creato un piccolo foro nella cornea interna dell'occhio.

Quindi il morfo gene specifico viene iniettato nel vitreo. Infine, il morfo viene elettroporato nelle cellule retiniche. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una ridotta espressione della proteina bersaglio attraverso la microscopia a immunofluorescenza di sezioni di tessuto retinico o l'immunoblotting.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie degenerative della retina come la retinite pigmentosa. A causa del potenziale di chiarire i meccanismi alla base della proliferazione delle cellule gliali di Mueller nella retina danneggiata, potremmo trovare il modo di indurre una risposta simile nel danno alla retina umana. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla rigenerazione retinica nella retina adulta del pesce zebra, può essere leggermente modificato per fornire informazioni in altri processi nella retina, come il ruolo di proteine specifiche nella fototrasduzione o nell'elaborazione visiva.

Dimostrazione della procedura sviluppata dal Dr.Ryan Tummel mentre era un postdoc. Nel mio laboratorio ci sarà il Dr.Travis Bailey, un attuale postdoc nel mio laboratorio. Prima di lavorare con i pesci, preparare morphos marcati con lissamina caricata positivamente che possono essere elettroporati in cellule diluendo 300 NMO di Morpho in 100 microlitri di acqua priva di nucleasi in soluzione di verde acqua a tre millimolari.

Per rimuovere lo strato corneale esterno, anestetizzare il pesce zebra di età compresa tra sei e 12 mesi in un milligrammo per millilitro di trica o due feth etanolo nell'acqua dell'acquario del pesce zebra, avvolgere il pesce zebra in un pezzo di carta assorbente inumidito che copre le branchie, ma lasciando l'occhio esposto. Posizionare il pesce avvolto sotto uno stereoscopio e aumentare l'ingrandimento fino a quando il diametro dell'occhio riempie circa un terzo del campo visivo. Successivamente, utilizzando una pinzetta Dumont numero cinque, afferrare la cornea esterna vicino alla fessura ottica nel sito di una leggera sporgenza o labbro per evitare che l'occhio si sposti.

Quando rimuovi la cornea, fissala con un altro paio di pinzette. Quindi tirare con un angolo basso attraverso l'occhio per rimuovere la cornea. Immediatamente dopo la rimozione della cornea esterna, utilizzare un bisturi a lama di zaffiro per praticare una piccola incisione nella cornea dove la pupilla incontra il carico dell'iride.

Puntare cinque microlitri della soluzione morpho in una siringa Hamilton dotata di un ago smussato rimovibile calibro 33. Tubalo su e giù per rimuovere l'airable nella linea. Inserire con cautela l'ago nel vitreo attraverso l'incisione.

Non inserire l'ago troppo in profondità per evitare di perforare la retina o spostare la lente. Iniettare lentamente la soluzione morpho nello spazio del vetriolo. Il vitreo incolore fuoriesce dall'incisione quando viene spostato dalla soluzione morpho.

Iniettare fino a quando una piccola quantità di morpho fuoriesce dall'incisione. Il morino marcato con lissamina dovrebbe essere chiaramente visibile all'interno dell'occhio. Dopo l'iniezione, riportare il pesce nella vasca per riprendersi utilizzando l'altro occhio come controllo non iniettato, impostare i parametri di elettroporazione su due impulsi consecutivi di 50 millisecondi a 75 volt.

Con una pausa di un secondo tra i legumi dopo l'iniezione di circa 10 pesci. Anestetizzare nuovamente un pesce iniettato e avvolgerlo in un pezzo di carta inumidito. Asciugamano che copre appena le branchie, ma lascia l'occhio scoperto.

Trasferire il pesce in una capsula di Petri riempita di anestesia. Con le mani guantate, tenere delicatamente il pesce sul fondo del piatto riempito di anestesia, avendo cura di immergere completamente l'occhio. Per colpire la retina dorsale, premere delicatamente l'elettrodo positivo verso il basso sulla metà ventrale dell'occhio, provocando la rotazione dell'occhio ed esponendo la parte dorsale del bulbo oculare mentre si continua a premere sul lato ventrale, posizionare l'elettrodo negativo a 0,5 a un millimetro di distanza dalla metà dorsale esposta dell'occhio.

Evitare di posizionare l'elettrodo negativo direttamente sull'occhio in quanto ciò danneggerebbe la retina dorsale. Dopo aver determinato la distanza appropriata tra gli elettrodi, regolare la vite sull'impugnatura degli elettrodi per mantenere una diffusione costante per la successiva elettroporazione. Elettroporare l'occhio e riportare il pesce in una vasca con acqua fresca per rianimare sottoporre immediatamente il pesce a una procedura che provoca cambiamenti nell'espressione genica retinica, come la degenerazione retinica indotta dalla luce costante.

Quando le retine vengono sezionate da nasale a temporale sull'asse ventrale dorsale, le caselle blu ombreggiate rappresentano le aree retiniche che sono più spesso danneggiate dall'evento di elettroporazione stesso. Il riquadro rosa ombreggiato rappresenta l'area che viene presa di mira per l'introduzione della morfo nelle cellule retiniche mediante elettroporazione. Come mostrato qui nell'immagine a destra tre giorni dopo l'elettroporazione, l'etichetta della lissamina è ancora visualizzata in tutti gli strati e i tipi di cellule in una retina sezionata, inclusi i segmenti esterni dell'asta, lo strato nucleare esterno, lo strato interclear e lo strato delle cellule ganglionari.

L'immagine vuota a sinistra è dell'occhio non iniettato, privo di qualsiasi morino marcato con lissamina, il knockdown completo della proteina può essere raggiunto attraverso tre o cinque giorni dopo l'elettroporazione a seconda dell'efficacia del morfo. In questo esempio, un morfo di controllo negativo o un morfo A-P-C-N-A è stato elettroporato nelle retine e le retine sono state rimosse dopo un'esposizione di uno, due o tre giorni alla luce, il tessuto è stato quindi processato e immunocolorato con anticorpi anti PCNA. Molte cellule PC NA positive in verde sono state osservate in tutte e tre le retine di controllo, ma l'espressione di PCNA era significativamente ridotta nelle retine di morfina.

Una volta padroneggiata questa tecnica, dovresti essere in grado di eseguire la procedura su circa 20 pesci in un'ora. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non toccare gli elettrodi direttamente sull'occhio del pesce dopo questa procedura. Altri metodi come l'immunoistochimica, la situ-ibridazione, la PCR in tempo reale e l'immuno blotting possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali percorsi genetici sono necessari nella rigenerazione retinica.