Name: La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Scopri l'imaging del calcio nei neuroni di Drosophila melanogaster durante il comportamento alimentare. Questo metodo consente di correlare l'attivazione neuronale con la risposta di estensione della proboscide in tempo reale.

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Ringrazio Watanabe L, M Gorczyca e altri membri del laboratorio Yoshihara per gli utili commenti e discussioni. Ringrazio K. Scott e L. Looger per gli stock finestre, S Yokoyama per dimostrare esperimenti, Shinya Iguchi per assistenza tecnica e Nobuko Yoshihara di materiale informativo. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Mental Health MH85958 Grants, e la Fondazione Worcester a MY

1. Costruire le MOSCHE <ol><li> Forma una piattaforma dal coperchio della piastra da 35 mm Falcon fondendo la parete laterale e intaglio per formare un angolo appropriato e spessore (Figura 1a; Figura 2). Eseguire un foro nella piattaforma di accettare la testa fly (Figura 1a, b), tale che i boccale sono liberamente esposta all&#39;esterno della camera (Figura 1a). Tagliare l&#39;estremità di una punta Pipetman, con la dimensione corrispondente al volo da osservare. Incollare la punta alla piattaforma come mostrato nella Figura 1a per completare le mosche (Figura 2). </li></ol> 2. Preparazione del Fly per l&#39;osservazione <ol><li> Starve uno mosca adulta per 24 ore a 25 ° C prima dell&#39;esperimento ponendolo in un flaconcino con solo un tovagliolo di carta bagnata, fame se è necessario. </li><li> Anestetizzare la mosca ponendolo in un tubo di 15 ml di plastica in piedi sul ghiaccio. </li><li> Con pinze, inserire una mosca nella camera delVOLA, e spingere delicatamente la mosca fino a quando non è in grado di muoversi. Quindi, inserire una spina per mantenere il volo. (Figura 1a, b). </li><li> Sigillare le parti circostanti della prossimali proboscide (rostro) al bordo interno del foro, applicare una piccola quantità di luce La colla (Tetric EvoFlow) ai lati e al di sopra del rostro dall&#39;esterno (frecce in figura 3). Anche applicare la colla dall&#39;interno delle mosche allo spazio tra la parte dorsale della testa e il bordo interno del foro (Figura 1b). Per consentire la tribuna di muoversi liberamente, occorre prestare attenzione per evitare che la colla di toccare il podio utilizzando un ciglio (o qualcosa di simile) per diffondere la colla. Infine, curare la colla con il più debole illuminazione della luce blu sufficienti per la cura per evitare di danneggiare la mosca dal calore eccessivo. Togliere il tappo. </li><li> Un filo di tenere il rostro parzialmente sollevato (freccia in figura 3) possono essere impiegati per stabilizzare la mosca &#39;testa di s evitando urto della parte faringea di SOG e per esporre la parte ventrale del SOG, soprattutto per i terminali di imaging presinaptici di neuroni Gr5a 8, che sono coperti da una parte della faringe quando la proboscide è completamente retratto. </li><li> Riempire la superficie della piattaforma con un senza zucchero contenenti salina (in mM): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4,5, CaCl 2, 1,5, e HEPES-NaOH, 5 con un pH di 7,1 10. Questo saccarosio senza soluzione salina ha tonicità simili a quelli di uso comune contenente saccarosio saline come HL3.1 11. </li><li> Aprire la capsula testa con una lama in tungsteno e pinze con le punte affilate come forbici, che è un dispositivo su misura e originariamente progettato dal Dr. Kageyuki Yamaoka, il Giappone, per tagliare le cuticole e trachea per esporre il SOG (Figura 4). Il bordo ventrale della cuticola testa è stata tagliata come ventrale più possibile, mentre il taglio bordo dorsale non era così critico. In primo luogo, fare un incisione attraverso l&#39;margine posteriore usando una lama di tungsteno. Quindi, tagliare la parte ed i bordi anteriori con le pinze appuntite. Il pezzo cuticola taglio deve essere sollevato con le pinze e rimossi. Nervi Antenne e antenne dovrebbero essere tagliati fuori dalle pinze appuntite. </li><li> Per evitare artefatti movimento durante la registrazione, il cervello deve essere stabilizzate mediante l&#39;asportazione di alcune parti della mosca. In primo luogo, rimuovere selettivamente i sacchi aerei tra la SOG e cuticola. Tagliare il esofago alla fine verso la faringe e alla fine entrare nel SOG rimuovere la connessione tra la faringe e il cervello. Quindi estrarre Muscle 16 12, e, infine, staccare qualsiasi trachea che collega il cervello e la cuticola. </li><li> Abbiamo impostato le nostre mosche sul palcoscenico di un microscopio Olympus BX51WI collegato ad un sistema di rotazione del disco microscopio confocale (Improvision in PerkinElmer) (Figura 5). Una lente immersione in acqua, ad esempio 40X/0.8 NA, è stata immersa nella vasca (figura 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + Imaging of the Brain <ol><li> Ca 2 + immagini utilizzando GCaMP3.0 1, 9 è stata effettuata mediante il metodo stabilito da Marella et al. 8 (Figura 6). Utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (Improvision), prendere una singola sezione ottica a 4 Hz con un tempo di esposizione di 122ms con 491nm laser di eccitazione, di messa a fuoco la regione di interesse (un corpo cellulare di un neurone motore, o un interneurone, o terminali presinaptici gustative dei neuroni sensoriali) con software Velocity, ver. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. Stimolare la proboscide <ol><li> Aspirare 100mM soluzione acquosa di saccarosio in un ago ipodermico con uno stoppino piccolo (a base di carta giapponese Washi, vedere tabella di reagenti specifici) sporgente dalla punta (Figura 7). </li><li> Scaricare una piccola goccia di soluzione di saccarosio sul stoppino, quindi, aspirare, immediatamente before applicando il bagnato stoppino di carta Washi alla punta della proboscide. Lo stoppino di carta Washi deve essere applicata solo per un istante per evitare di sazietà (Figura 8). Monitorare la risposta estensione proboscide (PER) comportamento utilizzando una fotocamera CCD collegata ad un microscopio di dissezione (Figura 5) simultaneamente con Ca 2 + imaging. I dati devono essere prese entro un&#39;ora dopo aver iniziato la dissezione perché la risposta PER non viene mantenuta più di un&#39;ora in queste condizioni. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Motoneuroni del goniometro rostro, una coppia di muscoli principali responsabili per il sollevamento del rostro dell&#39;estensione proboscide, sono stati segnalati per mostrare le risposte robusti agli stimoli dolci 13. Figura 9 mostra Ca 2 + segnali attraverso GCaMP3.0 1, 9 espressa da un Gal 4 driver, E49 13, da un corpo cellulare del neurone motore. Come mostrato nel video, uno Robuv è stata osservata in sincronia con un aumento Ca 2 + segnale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del cervello Fly live Imaging ed Elettrofisiologia Stage (aria). uno, le mosche è costruito in modo tale che l&#39;angolo della parete permette la testa mosca uscire dritto. Tre segmenti della proboscide mosca sono color-coded, il podio è il magenta. La mosca viene inserito nella camera con una pinza, e un pezzo tagliato dalla estremità di una punta Pipetman è connessa al retro della camera di bloccare la fuoriuscita mosca. B, il foro è annoiato conforme alla testa della mosca. Le lacune rimanenti vengono sigillati con la colla luce, come indicato per garantire che non vi siano perdite. Dopo che la colla è asciutta, la punta Pipetman come una presa è stata rimossa. Saline viene versato nei MOSCHE tali che la superficie del cervello è completamente coperto. Occorre garantire che non vi siano perdite salinezare successivamente sull&#39;estremità anteriore della testa mosca. L&#39;area ombreggiata circondata dalla linea tratteggiata in pannello b mostra la parte da sezionati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografia delle mosche. La parete a forma di mezzaluna di colla (una pistola da colla) è fatto per controllare il flusso di soluzione salina durante la perfusione, e per ridurre la quantità di soluzione salina utilizzata. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Figura 3. Vista frontale di una mosca montato le mosche. Questa immagine mostra come una mosca si trova nelle mosche e come la luce-colla viene applicata intorno alla testa della mosca (frecce) per creare una soluzione salina a prova di tenuta. Se eventuali perdite saline fino ai proboscide della mosca, poi l&#39;esperimento avrà esito negativo. Il filo (frecce) legato alla fase è di tenere la proboscide in posizione, così che non è completamente retrazione<html> ted. Altrimenti sarebbe ostruire la parte più ventrale del SOG e causare artefatti da movimento. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Figura 4. Top-view delle mosche con una mosca sezionato. Questa immagine mostra l&#39;esposto di SOG successivo alla rimozione delle cuticole mosca. L&#39;esofago, Muscle 16 e trachee collegato al cervello, nonchè selezionati aria sacchi sono stati rimossi per impedire loro di disturbare il cervello, che può portare a artefatti nei segnali di calcio. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;apparecchiatura di monitoraggio. Questo apparato è assemblato da un microscopio Olympus BX51WI collegata a un sistema di filatura microscopio confocale disco (Improvision), e un lato montato SMZ800 microscopio Nikon. Questa configurazione permette di live-imaging di attività cerebrale durante PER comportamento. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Fotografie per mostrare la vista laterale delle mosche. Lo strato sottile di soluzione fisiologica è inserita tra l&#39;acqua 40X-obiettivo a immersione e la mosca. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Figura 7. Schema per la realizzazione del stoppino di carta Washi. Gampi-Washi carta è una pergamena tradizionale giapponese che è estremamente sottile e liscio (Haibara, Giappone). È anche molto forte e può mantenere una grande quantità di liquido. La carta Washi deve essere tagliato in un trapezio con dimensioni molto specifici 0,3 mm e 0,7 mm di larghezza, e 4-5 mm in lunghezza (a). Questo trapezoidale viene quindi inserita dal lato 0,7 millimetri nella punta di un ago ipodermico 23 e G può anche essere stabilizzate mediante l&#39;inserimento di un perno di insetto, che è piegata a forma di V (b). C, la carta Washi diventa trasparenti in seguito all&#39;esposizionead un liquido, che lo rende ideale per questo esperimento. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> Figura 8. La stimolazione della proboscide sulle vola alla Washi-stoppino. Lo stoppino di carta Washi sulla punta di un ago ipodermico viene applicata per un istante utilizzando un manipolatore joystick con una mano. L&#39;ago è collegata tramite un tubo flessibile ad un iniettore manipolato con l&#39;altra mano, per l&#39;aspirazione e lo scarico soluzione di saccarosio. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Figura 9. Rappresentativi dei risultati. uno, PER comportamento registrato attraverso la camera CCD installato sul stereomicroscopio. Vista frontale di una mosca affamata con una proboscide estesi (frecce) prima della stimolazione, alla stimolazione, e dopo la stimolazione con uno stoppino contenente 100 mM saccarosio in soluzione acquosa (punta di freccia). L&#39;illuminazione è compiuta da un laser a 491 nm utilizzatoper GCaMP fluorescenza. b, saccarosio-indotta GCaMP 3,0 risposta nel neurone motore per il goniometro del muscolo rostro nello stato affamato. Il pannello superiore, la prima stimolazione, il pannello inferiore, immediatamente dopo la stimolazione. Bar Scala, 10 micron. C, Quantificazione del saccarosio indotta risposta GCaMP 3.0. Il neurone motore risponde ad uno stimolo saccarosio da un forte aumento nella fluorescenza seguita da una fase di ripristino di alcuni secondi per la linea di base.

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</ol>

<p class="jove_content"&gt; Non ho nulla da rivelare.</p

Le MOSCHE consente la registrazione simultanea di Ca 2 + PER segnali e comportamenti. Anche con il cervello esposto a un comportamento normale soluzione salina è stata osservata. Utilizzando il Gampi-Washi stoppino al posto di uno stoppino Kimwipe utilizzato nel method7 originale capillare facilita un comportamento altamente riproducibile e stabile PER ed evita la necessità di diventare abili nel fare e la scelta di uno stoppino buona Kimwipe. Le punte sperimentali sopra indicato permesso di evitare perturbazioni con successo dal movimento della proboscide, portando a una registrazione molto stabile di Ca 2 + segnali a basso rumore. Di tanto in tanto, la rimozione dei tessuti non è stato sufficiente per esporre le cellule o sopprimere il movimento in maniera adeguata, porta a scarsi risultati. Tuttavia, una volta erano esperti, oltre l&#39;80% dei preparati prodotto buoni risultati. Questa metodologia è non solo per l&#39;imaging Ca 2 +, ma può anche essere adattata a qualsiasi immagine dal vivo osservando PER comportamento. Ad esempio, possiamo accedere a qualsiasi cella attraverso ilutilizzo di un elettrodo per registrare direttamente attività. In combinazione con due fotoni microscopia eccitazione, siamo in grado di effettuare l&#39;imaging lasso di tempo struttura sinaptica, che possono essere correlate a cambiamenti comportamentali. Pertanto, questo metodo di immagini cerebrali con osservazione del comportamento non è valida soltanto per la dissezione funzionale della rete neuronale, ma potrebbe essere usato come un potente strumento per correlare 14 plasticità sinaptica per i meccanismi alla base della memoria.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di attrezzature / Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Light-colla </td></tr><tr><td> BX51WI Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td> Con 40X (NA 0,8) lente dell&#39;obiettivo immersione in acqua </td></tr><tr><td> Spinning sistema di microscopia confocale disco </td><td> Improvision in PerkinElmer </td><td></td><td> Con il laser 491 nm </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> Attaccato ad un braccio oscillante. Visione stereo è ancora disponibile con registrazione video </td></tr><tr><td> Gampi-carta Washi </td><td> Haibara, Giappone </td><td></td><td> Un tipo speciale di carta tradizionale giapponese </td></tr><tr><td> CCD della fotocamera </td><td> Imaging Source </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 pixel CCD SONY </td></tr><tr><td> Joystick manipolatore </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettore </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

la registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di drosophila melanogaster</em

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Per studiare reti neuronali in termini della loro funzione nel comportamento, dobbiamo analizzare come i neuroni funzionano quando ogni modello comportamentale viene generato. Così, registrazioni simultanee di attività neuronale e comportamento sono essenziali per correlare l&#39;attività del cervello al comportamento. Per tali analisi comportamentali, il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, ci consente di incorporare gli indicatori di calcio geneticamente codificate come GCaMP 1, per monitorare l&#39;attività neuronale, e di utilizzare sofisticate manipolazioni genetiche per le tecniche di optogenetic o termogenetica di attivare specificamente identificati neuroni 2-5. L&#39;uso di una tecnica termogenetica ci ha portato a trovare i neuroni fondamentali per comportamento alimentare (Flood et al., In corso di revisione). Come parte principale del comportamento alimentare, un adulto Drosophila estende la sua proboscide per l&#39;alimentazione 6 (estensione di risposta proboscide; PER), in risposta ad uno stimolo dolce da cellule sensoriali sulla sua proboscide o Tarsi. Combining il protocollo per PER 7 con una tecnica di imaging di calcio 8 utilizzando GCaMP3.0 1, 9, ho stabilito un sistema sperimentale, dove si può monitorare l&#39;attività dei neuroni nel centro nutrizionale - il ganglio suboesophageal (SOG), in contemporanea con l&#39;osservazione del comportamento della proboscide. Ho progettato un apparecchio (&quot;Fly cervello vivo Imaging e Stadio Elettrofisiologia&quot;: &quot;VOLA&quot;) per ospitare un adulto Drosophila, permettendo la sua proboscide di muoversi liberamente mentre il suo cervello è esposto al bagno per Ca 2 + immagini attraverso una lente di immersione in acqua . I MOSCHE è anche adatto per molti tipi di esperimenti dal vivo sul cervello mosca come la registrazione elettrofisiologica o lapse imaging momento della morfologia sinaptica. Poiché i risultati di immagini dal vivo può essere direttamente correlata con il comportamento PER simultanea, questa metodologia in grado di fornire un ottimo sistema sperimentale per studiare l&#39;elaborazione delle informazioni delle reti neuronali, e come questo cattività ellular è accoppiato ai processi di plastica e memoria.

La mosca della frutta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Si estende la sua proboscide per l&#39;alimentazione, rispondendo ad uno stimolo zucchero dalla sua proboscide o del tarso. Ho unito le osservazioni della risposta estensione proboscide (PER) con una tecnica di imaging di calcio, che ci permette di monitorare l&#39;attività dei neuroni nel cervello, in contemporanea con l&#39;osservazione comportamentale.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

Per studiare le reti neuronali in termini della loro funzione nel comportamento, è necessario analizzare come operano i neuroni durante la generazione di ogni singolo schema comportamentale. Pertanto, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare l'attività neuronale mediante imaging del calcio simultaneamente all'osservazione del comportamento alimentare. Questo viene ottenuto inserendo innanzitutto una mosca nell'apparato per mosche. Successivamente, la testa della mosca viene dissezionata per esporre il cervello.L'apparato della mosca con la mosca dissezionata viene quindi posizionato sul palco del microscopio. L'ultimo passaggio della procedura consiste nella stimolazione del pro Bois mediante uno stoppino zuccherino. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'attivazione di un neurone identificato tramite imaging del calcio, correlata all'estensione del Probus attraverso la videoregistrazione del comportamento.L'idea per questo metodo mi è venuta pensando agli occhi delle birre che battono, galleggiando sulla superficie dell'acqua. Noi birre abbiamo occhi divisi e possiamo vedere sia sopra che sotto la superficie dell'acqua. Un punto delicato del mio esperimento è che il cervello e le SCU sono vicini tra loro, ma se sono ben separati, come gli occhi delle nostre birre, possiamo mantenere le SCU asciutte mentre il cervello è esposto nel satellite.Ho creato una partizione molto semplice appena sopra le SCU per separare la parte asciutta dallo spazio di larghezza, modellando una piattaforma dal coperchio di una piastra Falcon da 35 millimetri sciogliendo la parete laterale e sagomandola in modo da ottenere un angolo e uno spessore adeguati. Praticare un foro nella piattaforma per alloggiare la testa della mosca, in modo che le parti boccali siano liberamente esposte all'esterno della camera. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta in modo che sia abbastanza larga da contenere il corpo della mosca, quindi incollare il puntale sulla piattaforma.Dopo aver sottoposto un moscerino adulto a digiuno per 24 ore a 25 gradi Celsius, anestetizzare il moscerino ponendolo in un tubo di plastica da 15 millilitri, appoggiato sul ghiaccio, utilizzando pinzette. Inserire un moscerino nella camera dei moscerini e spingerlo delicatamente finché non riesce più a muoversi.Sigillare le parti circostanti della proboscide o del rostro al bordo interno del foro applicando una piccola quantità di colla fotopolimerizzabile sui lati e sulla parte superiore del rostro, utilizzando un ciglio o uno strumento simile per stendere con cura la colla. Applicare inoltre la colla dall'interno delle mosche allo spazio tra la parte dorsale della testa e il bordo interno del foro. Infine, polimerizzare la colla con l'illuminazione più debole di luce blu sufficiente per la polimerizzazione, al fine di evitare di danneggiare la mosca.Per stabilizzare la testa della mosca ed esporre la parte ventrale del SOG, fissare un filo per mantenere il rostro parzialmente sollevato. Con la mosca in posizione, riempire la superficie della piattaforma con soluzione salina priva di saccarosio. Aprire la capsula cefalica per esporre il SOG utilizzando una lama al tungsteno e pinzette con punte affilate, che chiamiamo pinzette affilate.Forbici per microchirurgia. Questa è una dimostrazione dell'utilizzo delle forbici per microchirurgia, in cui viene tagliata una fibra da un fazzoletto Kim per effettuare un confronto. L'operazione viene eseguita prima con forbici ad iris nel campo visivo, e successivamente davanti a un righello graduato di un millimetro.Per prima cosa, utilizzando la lama di tungsteno, effettuare un'incisione attraverso il margine posteriore. Successivamente, tagliare i margini laterale e anteriore usando la pinzetta affilata. Sollevare il frammento di cuticola tagliato con la pinzetta ed eliminarlo.Tagliare le antenne e i nervi antennali utilizzando la pinzetta. Successivamente, rimuovere selettivamente le sacche d'aria tra il SOG e la cuticola per stabilizzare il cervello ed evitare artefatti di movimento. Successivamente, tagliare l'esofago all'estremità rivolta verso la faringe e all'estremità che entra nel SOG, al fine di rimuovere la connessione tra faringe e cervello.Successivamente, dopo aver identificato ed estratto il muscolo 16, staccare qualsiasi trachea che collega il cervello alla cuticola. Posizionare le mosche sul palco di un microscopio confocale a disco rotante e passare all'obiettivo ad immersione in acqua per l'acquisizione delle immagini. Quindi acquisire una singola sezione ottica a quattro hertz con un tempo di esposizione di 122 millisecondi, utilizzando un laser di eccitazione a 491 nanometri focalizzato sulla regione di interesse.Utilizzare un ago da siringa con un piccolo stoppino di carta giapponese che sporge dalla punta per offrire saccarosio alla mosca. Rilasciare una piccola goccia di soluzione di saccarosio sullo stoppino, quindi aspirarla con un iniettore collegato all'ago tramite un tubo flessibile, utilizzando un manipolatore a joystick per tenere l'ago.Applicare l'attizzatoio di carta assorbente inumidito sulla punta delle proboscidi, ma solo per un istante, per evitare sazietà. Monitorare la risposta di estensione del PROBUS o il comportamento PER utilizzando una telecamera CCD collegata a un microscopio stereoscopico simultaneamente all'acquisizione dell'immagine del calcio, e assicurarsi di raccogliere i dati entro un'ora dalla dissezione.Qui è mostrata una tipica risposta di protrusione del proboscide alla stimolazione con un WIC contenente saccarosio 100 millimolare. Soluzione acquosa immagine mediante un laser a 491 nanometri per la fluorescenza di G CAMP. L'acquisizione simultanea dell'immagine del calcio durante il comportamento di risposta di protrusione del proboscide, mostrata qui prima e poi dopo la stimolazione, permette la visualizzazione delle risposte indotte da saccarosio di GAMP 3.0 nel neurone motore del muscolo protrattore del rostro.Nella stella della quantificazione dello stato della risposta GAMP 3.0 indotta da saccarosio si osserva che i neuroni motori rispondono a uno stimolo di saccarosio con un rapido aumento della fluorescenza, seguito da una fase di ripristino di diversi secondi fino al valore basale. La piattaforma consente l'uso di altre metodiche come l'elettrofisiologia o l'optogenetica o la psicogenetica, oppure l'attivazione chimica dei neuroni o l'acquisizione di immagini in TimeLapse di strutture marcate con GFP al fine di rispondere a ulteriori domande, come la correlazione tra plasticità sinaptica e memoria.

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Descriviamo una tecnica consolidata per misurare e analizzare i cattivi odori evocati risposte di calcio nel lobo antennale di...

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

Questo video descrive l'imaging del calcio in vivo nei neuroni di Drosophila utilizzando GCaMP. La clip del protocollo in primo piano mostra come registrare i cambiamenti nella fluorescenza GCaMP dai neuroni del corpo a fungo durante un esperimento di condizionamento olfattivo.

Drosophila In Vivo Imaging del calcio: un metodo per l'imaging funzionale dell'attività neuronale

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Imaging del calcio: un metodo per visualizzare l'attività neurale in C. elegans vivo

Questo video dimostra una tecnica per l'imaging del calcio nei singoli neuroni di Caenorhabditis elegans che si comportano utilizzando proteine reporter fluorescenti geneticamente codificate. Delinea i passaggi coinvolti nell'imaging del movimento dei vermi e nella misurazione dei rapporti di fluorescenza del reporter dai neuroni per correlare i livelli intracellulari di calcio con l'attività neuronale e i cambiamenti comportamentali durante la deposizione delle uova.

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Questo video mostra un metodo per l'imaging del calcio in vivo utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente nei moscerini. Descrive i passaggi per preparare i moscerini per la microscopia, condurre il condizionamento olfattivo e visualizzare l'afflusso di calcio indotto dagli odori.

in vivo Imaging del calcio utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente in Drosophila melanogaster

Fonte: Ishimoto, H. et. Al., Imaging del calcio ex vivo per la visualizzazione delle risposte cerebrali alla segnalazione endocrina in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Questo video dimostra l'imaging del calcio da studiareDrosophila risposte cerebrali ai neuropeptidi. I neuroni che esprimono un indicatore fluorescente di calcio rivelano la dinamica intracellulare del calcio e le risposte funzionali alle molecole di segnalazione.

Imaging ex vivo del calcio per studiare le risposte cerebrali della Drosophila ai neuropeptidi

Registrazioni simultanee extracellulari lungo termine provenienti da due diversi neuropiles cerebrali o due diversi tratti anatomici sono stati stabiliti nelle api. Queste registrazioni permettono lo studio di aspetti temporali del trattamento neuronale attraverso diverse aree cerebrali del singolo neurone, così come a livello di complesso in un animale comportarsi.

Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

Le zampe anteriori e la proboscide di Drosophila contengono un ricco repertorio di neuroni sensoriali gustativi. Qui, presentiamo un metodo che utilizza l'imaging del calcio per misurare le risposte fisiologiche dei neuroni sensoriali nella zampa anteriore e nella proboscide di moscerini vivi dopo l'applicazione esogena di un feromone gustativo.

Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

Questo protocollo descrive l'uso di codificato geneticamente Ca2 + reporter per registrare le modifiche attività neurale in comportarsi vermi di Caenorhabditis elegans .

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta che esprime GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare gli eventi ictali nella Drosophila adulta attraverso l'imaging del calcio ex vivo , consentendo l'esplorazione dei potenziali meccanismi dell'epilessia a livello cellulare.

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Scopri l'imaging del calcio nei neuroni di Drosophila melanogaster durante il comportamento alimentare. Questo metodo consente di correlare l'attivazione neuronale con la risposta di estensione della proboscide in tempo reale.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster /em (Video) | JoVE Journal

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster

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