La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare l'attività neuronale mediante imaging del calcio simultaneamente all'osservazione del comportamento alimentare. Questo viene ottenuto inserendo innanzitutto una mosca nell'apparato per mosche. Successivamente, la testa della mosca viene dissezionata per esporre il cervello.

L'apparato della mosca con la mosca dissezionata viene quindi posizionato sul palco del microscopio. L'ultimo passaggio della procedura consiste nella stimolazione del pro Bois mediante uno stoppino zuccherino. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'attivazione di un neurone identificato tramite imaging del calcio, correlata all'estensione del Probus attraverso la videoregistrazione del comportamento.

L'idea per questo metodo mi è venuta pensando agli occhi delle birre che battono, galleggiando sulla superficie dell'acqua. Noi birre abbiamo occhi divisi e possiamo vedere sia sopra che sotto la superficie dell'acqua. Un punto delicato del mio esperimento è che il cervello e le SCU sono vicini tra loro, ma se sono ben separati, come gli occhi delle nostre birre, possiamo mantenere le SCU asciutte mentre il cervello è esposto nel satellite.

Ho creato una partizione molto semplice appena sopra le SCU per separare la parte asciutta dallo spazio di larghezza, modellando una piattaforma dal coperchio di una piastra Falcon da 35 millimetri sciogliendo la parete laterale e sagomandola in modo da ottenere un angolo e uno spessore adeguati. Praticare un foro nella piattaforma per alloggiare la testa della mosca, in modo che le parti boccali siano liberamente esposte all'esterno della camera. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta in modo che sia abbastanza larga da contenere il corpo della mosca, quindi incollare il puntale sulla piattaforma.

Dopo aver sottoposto un moscerino adulto a digiuno per 24 ore a 25 gradi Celsius, anestetizzare il moscerino ponendolo in un tubo di plastica da 15 millilitri, appoggiato sul ghiaccio, utilizzando pinzette. Inserire un moscerino nella camera dei moscerini e spingerlo delicatamente finché non riesce più a muoversi.

Sigillare le parti circostanti della proboscide o del rostro al bordo interno del foro applicando una piccola quantità di colla fotopolimerizzabile sui lati e sulla parte superiore del rostro, utilizzando un ciglio o uno strumento simile per stendere con cura la colla. Applicare inoltre la colla dall'interno delle mosche allo spazio tra la parte dorsale della testa e il bordo interno del foro. Infine, polimerizzare la colla con l'illuminazione più debole di luce blu sufficiente per la polimerizzazione, al fine di evitare di danneggiare la mosca.

Per stabilizzare la testa della mosca ed esporre la parte ventrale del SOG, fissare un filo per mantenere il rostro parzialmente sollevato. Con la mosca in posizione, riempire la superficie della piattaforma con soluzione salina priva di saccarosio. Aprire la capsula cefalica per esporre il SOG utilizzando una lama al tungsteno e pinzette con punte affilate, che chiamiamo pinzette affilate.

Forbici per microchirurgia. Questa è una dimostrazione dell'utilizzo delle forbici per microchirurgia, in cui viene tagliata una fibra da un fazzoletto Kim per effettuare un confronto. L'operazione viene eseguita prima con forbici ad iris nel campo visivo, e successivamente davanti a un righello graduato di un millimetro.

Per prima cosa, utilizzando la lama di tungsteno, effettuare un'incisione attraverso il margine posteriore. Successivamente, tagliare i margini laterale e anteriore usando la pinzetta affilata. Sollevare il frammento di cuticola tagliato con la pinzetta ed eliminarlo.

Tagliare le antenne e i nervi antennali utilizzando la pinzetta. Successivamente, rimuovere selettivamente le sacche d'aria tra il SOG e la cuticola per stabilizzare il cervello ed evitare artefatti di movimento. Successivamente, tagliare l'esofago all'estremità rivolta verso la faringe e all'estremità che entra nel SOG, al fine di rimuovere la connessione tra faringe e cervello.

Successivamente, dopo aver identificato ed estratto il muscolo 16, staccare qualsiasi trachea che collega il cervello alla cuticola. Posizionare le mosche sul palco di un microscopio confocale a disco rotante e passare all'obiettivo ad immersione in acqua per l'acquisizione delle immagini. Quindi acquisire una singola sezione ottica a quattro hertz con un tempo di esposizione di 122 millisecondi, utilizzando un laser di eccitazione a 491 nanometri focalizzato sulla regione di interesse.

Utilizzare un ago da siringa con un piccolo stoppino di carta giapponese che sporge dalla punta per offrire saccarosio alla mosca. Rilasciare una piccola goccia di soluzione di saccarosio sullo stoppino, quindi aspirarla con un iniettore collegato all'ago tramite un tubo flessibile, utilizzando un manipolatore a joystick per tenere l'ago.

Applicare l'attizzatoio di carta assorbente inumidito sulla punta delle proboscidi, ma solo per un istante, per evitare sazietà. Monitorare la risposta di estensione del PROBUS o il comportamento PER utilizzando una telecamera CCD collegata a un microscopio stereoscopico simultaneamente all'acquisizione dell'immagine del calcio, e assicurarsi di raccogliere i dati entro un'ora dalla dissezione.

Qui è mostrata una tipica risposta di protrusione del proboscide alla stimolazione con un WIC contenente saccarosio 100 millimolare. Soluzione acquosa immagine mediante un laser a 491 nanometri per la fluorescenza di G CAMP. L'acquisizione simultanea dell'immagine del calcio durante il comportamento di risposta di protrusione del proboscide, mostrata qui prima e poi dopo la stimolazione, permette la visualizzazione delle risposte indotte da saccarosio di GAMP 3.0 nel neurone motore del muscolo protrattore del rostro.

Nella stella della quantificazione dello stato della risposta GAMP 3.0 indotta da saccarosio si osserva che i neuroni motori rispondono a uno stimolo di saccarosio con un rapido aumento della fluorescenza, seguito da una fase di ripristino di diversi secondi fino al valore basale. La piattaforma consente l'uso di altre metodiche come l'elettrofisiologia o l'optogenetica o la psicogenetica, oppure l'attivazione chimica dei neuroni o l'acquisizione di immagini in TimeLapse di strutture marcate con GFP al fine di rispondere a ulteriori domande, come la correlazione tra plasticità sinaptica e memoria.