La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare l'attività neuronale mediante imaging del calcio contemporaneamente all'osservazione del comportamento alimentare. Ciò si ottiene inserendo prima una mosca nell'apparato delle mosche. Successivamente, la testa della mosca viene sezionata per esporre il cervello.

L'apparato della mosca con la mosca sezionata viene quindi posizionato sul tavolino del microscopio. La fase finale della procedura è la stimolazione di pro Bois con uno stoppino di zucchero. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'attivazione di un neurone identificato attraverso l'imaging del calcio correlato all'estensione di Probus attraverso la videoregistrazione del comportamento.

L'idea di questo metodo mi è venuta per la prima volta quando ho pensato agli occhi delle birre che battono e che nuotano sulla superficie dell'acqua. Noi birre abbiamo gli occhi spaccati e possiamo vedere sia sopra che sotto la superficie dell'acqua. Un punto difficile del mio esperimento è che il cervello e le SCU sono vicini l'uno all'altro, ma se sono separati bene come gli occhi di noi birre, possiamo mantenere le SCU asciutte mentre il cervello è esposto nel satellite.

Questo ho realizzato un divisorio molto semplice appena sopra le SCU per separare la faccia asciutta dal posto di larghezza, Modellare una piattaforma dal coperchio di un piatto di falco da 35 millimetri sciogliendo la parete laterale e intagliandola per formare un angolo e uno spessore appropriati. Praticare un foro nella piattaforma per accogliere la testa della mosca, in modo tale che le parti della bocca siano liberamente esposte all'esterno della camera. Tagliare l'estremità di una punta dell'uomo della pipetta abbastanza larga da accogliere il corpo della mosca, quindi incollare la punta alla piattaforma.

Dopo aver fatto morire di fame, un adulto vola per 24 ore a 25 gradi Celsius. Anestetizzare la mosca mettendola in un tubo di plastica da 15 millilitri, stando sul ghiaccio con una pinza. Inserisci una mosca nella camera delle mosche e spingi delicatamente la mosca fino a quando non è in grado di muoversi.

Sigillare le parti circostanti del probos prossimale o del rostro al bordo interno del foro applicando una piccola quantità di colla fotopolimerizzabile ai lati e sopra il rostro, usando un ciglio o uno strumento simile per stendere accuratamente la colla. Applicare anche la colla dall'interno delle mosche nello spazio tra la parte dorsale della testa e il bordo interno del foro. Infine, polimerizza la colla con l'illuminazione più debole di luce blu sufficiente per l'indurimento per evitare di danneggiare la mosca.

Per stabilizzare la testa della mosca e per esporre la parte ventrale del SOG, attaccare un filo per tenere il rostro parzialmente sollevato. Con la mosca in posizione, riempire la superficie della piattaforma con soluzione salina priva di saccarosio. Aprire la capsula della testa per esporre il SOG utilizzando una lama di tungsteno e una pinza con punte affilate che chiamiamo pinze affilate.

Cerniere a forbice. Questa è una dimostrazione di cerniere a forbice, che tagliano una fibra da una salvietta Kim per confronto. Questo viene eseguito prima con le forbici dell'iride nel campo visivo e poi davanti a un righello graduato di un millimetro.

Per prima cosa, usando la lama di tungsteno, praticare un'incisione attraverso il bordo posteriore. Quindi tagliare i bordi laterali e anteriori utilizzando la pinza affilata. Sollevare il pezzo di cuticola tagliato con la pinza e rimuoverlo.

Taglia le antenne e i nervi dell'antenna usando il forcipe. Quindi rimuovere selettivamente le sacche d'aria tra il SOG e la cuticola per stabilizzare il cervello e prevenire artefatti di movimento. Successivamente, tagliare l'esofago all'estremità verso la faringe e all'estremità entrando nel SOG per rimuovere la connessione tra la faringe e il cervello.

Quindi, dopo aver identificato ed estratto il muscolo 16, staccare qualsiasi trachea che collega il cervello e la cuticola. Posiziona le mosche sul tavolino di un microscopio confocale a disco rotante e passa alla lente a immersione in acqua per l'imaging. Quindi prendi una singola sezione ottica a quattro hertz con un tempo di esposizione di 122 millisecondi utilizzando la messa a fuoco laser di eccitazione a 491 nanometri nella regione di interesse.

Usa un ago da siringa con un piccolo stoppino di giapponese. Stava forse della carta che sporgeva dalla punta per offrire saccarosio alla mosca? Scaricare una piccola goccia di soluzione di saccarosio sullo stoppino, quindi aspirarla con un iniettore collegato all'ago attraverso un tubo flessibile utilizzando un manipolatore joystick per tenere l'ago.

Applicare lo stoppino di carta lavata imbevuto sulla punta dei probs, ma solo per un istante. Per evitare la sazietà. Monitora la risposta dell'estensione PROBUS o il comportamento PER utilizzando una telecamera CCD collegata a un microscopio di dissezione contemporaneamente all'imaging del calcio e assicurati di raccogliere i dati entro un'ora dalla dissezione.

Qui è mostrata una tipica risposta di estensione di prob Bois alla stimolazione con un WIC contenente 100 millimolare di saccarosio. Soluzione acquosa ottenuta con un laser a 491 nanometri per la fluorescenza G CAMP. L'imaging simultaneo del calcio durante il comportamento di risposta all'estensione della prosa, mostrato qui prima e poi dopo la stimolazione, consente la visualizzazione delle risposte GAMP 3.0 indotte dal saccarosio nel motoneurone per il goniometro del muscolo rostro.

Nella stella di stato, la quantificazione della risposta GAMP 3.0 indotta dal saccarosio mostra che i motoneuroni rispondono a uno stimolo di saccarosio con un forte aumento della fluorescenza, seguito da una fase di ripristino di diversi secondi rispetto alla linea di base. La piattaforma fly consente altri metodi come l'elettrofisiologia, l'optogenetica o la psicogenetica, o l'attivazione chimica per i neuroni o l'imaging di laboratorio TimeLapse di strutture marcate GFP per rispondere a domande aggiuntive come la correlazione tra plasticità sinaptica e memoria.