In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Noi descriviamo un metodo per abbattere condizionale l'espressione di una proteina bersaglio durante la rigenerazione adulto pinna zebrafish. Questa tecnica comporta micro-iniezione e electroporating Morpholinos oligonucleotide antisenso nel tessuto pinna, che consente di testare il ruolo della proteina in varie fasi di rigenerazione pinna, tra la guarigione della ferita, la formazione blastema, e escrescenza rigenerativa.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di inibire o abbattere l'espressione di una proteina specifica nella pinna caudale del pesce zebra adulto rigenerante. Ciò si ottiene amputando prima la pinna caudale e consentendo a una piccola quantità di tessuto di rigenerarsi. La successiva soluzione morpho viene microiniettata in ogni blasa su una metà della pinna.

Il fenofeno morph viene quindi elettroporata nelle celle del blasa e l'altra metà della pinna viene elettroporata a scopo di controllo. Infine, viene analizzato l'effetto della ridotta espressione della proteina bersaglio sulla crescita rigenerativa. In definitiva, i risultati mostrano l'inibizione della rigenerazione tissutale attraverso l'analisi comparativa della crescita rigenerativa delle metà iniettate e non iniettate della pinna.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della guarigione delle ferite e alla medicina rigenerativa a causa del potenziale di scoprire geni e vie di segnalazione essenziali per la generazione dei tessuti. Per preparare il morino marcato con fluoresceina, diluire 300 nanomoli in 100 microlitri di acqua priva di nucleasi. Per ottenere una soluzione di circa tre millimolari, aliquotare la soluzione in più provette da microcentrifuga sigillate con paraffina e conservarla a temperatura ambiente al riparo dalla luce Per determinare l'esatta concentrazione di morfo, vedere il protocollo scritto per i dettagli.

Anestetizzare il pesce zebra adulto in trica o due fenossietanolo a un milligrammo per millilitro nell'acqua della vasca. Quando il pesce è completamente anestetizzato, posizionarlo sul coperchio pulito di una capsula di Petri e usando un bisturi sterile o una lama di rasoio amputare la pinna prossimalmente al primo punto di ramificazione tracheale lipidica, è importante tagliare la pinna perfettamente perpendicolare al piano anteriore posteriore dell'animale perché i tagli angolati provocheranno una crescita irregolare della pinna delle metà dorsale e ventrale della pinna. Rimetti il pesce nella vasca e mantienila a 33 gradi Celsius per aumentare la velocità di rigenerazione a seconda del peso del progetto sperimentale.

Da zero a due giorni dopo l'amputazione per la rigenerazione delle pinne. Per iniziare prima di introdurre il morfo, il giorno prima dell'iniezione di morfo, fare una piastra di iniezione con il 2% di agarosio che ha una tacca tagliata a un'estremità del pozzetto, che aiuterà a stabilizzare il pesce per la procedura di iniezione. Poco prima dell'iniezione, diluire il morfo marcato con fluoresceina e l'acqua libera da RNA e DNA alla concentrazione corretta e incubare in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius.

Per cinque minuti, caricare un ago per iniezione precedentemente preparato e tagliare la punta ad angolo. Quindi, anestetizzare il pesce e posizionarlo sulla piastra di iniezione. Rimuovere tutto il liquido in eccesso e posizionare la piastra sul tavolino di uno stereomicroscopio.

Orientare l'ago appena distalmente al raggio osseo. Inserire delicatamente l'ago nel tessuto rigenerativo appena distalmente a ciascun raggio osseo e spingere distalmente fino a quando non si trova nel blastema. Quando l'ago è localizzato correttamente, seguire le indicazioni del sistema di microiniezione e iniettare una goccia di cinque nanolitri di morpho per iniezione.

Ad ogni iniezione, si può vedere uno sbuffo giallo di soluzione morfo, che aiuta a localizzare l'iniezione nel blastema lavorando dorsalmente dalla linea mediana. Iniettare circa 75 nanolitri di morfo per raggio osseo sul lato dorsale, lasciando il lato ventrale come controllo di sola elettroporazione immediatamente dopo l'iniezione del morfo. Rimuovere la piastra di iniezione dall'apparecchio per microiniezione.

Riempire bene la piastra di iniezione con la soluzione di anestesia fino a quando il pesce non è sommerso. Per assicurarsi che gli elettrodi elettroporati non tocchino il tessuto della pinna, ruotare il pesce sul lato dorsale e guardare dritto lungo la linea mediana per l'elettroporazione. Impostare i parametri di elettroporazione su 10 impulsi consecutivi da 50 millisecondi a 15 volt con una pausa di un secondo tra gli impulsi con elettrodi pinzette a piastra in platino di tre millimetri di diametro posizionati vicino ma non a contatto.

Le pinne hanno elettroporicato sia il lato dorsale che quello ventrale della pinna per prevenire l'accumulo di carica da bolle che possono formarsi. Pulire gli elettrodi con un panno umido dopo ogni elettroporazione. Infine, posiziona il pesce su un vetrino o una capsula di Petri e riprendi rapidamente la pinna, assicurandoti di notare l'orientamento ventrale dorsale.

Questa immagine verrà utilizzata per l'analisi della ricrescita il giorno successivo. Rimetti il pesce nella vasca se la proteina mirata è necessaria per una corretta rigenerazione delle pinne. Una differenza drammatica tra la metà dorsale e quella ventrale della pinna dovrebbe essere evidente un giorno dopo l'elettroporazione o tre giorni dopo l'amputazione.

Scatta un'altra foto della pinna e abbina questa immagine con un'immagine corrispondente di due giorni dopo l'amputazione scattata dopo l'elettroporazione. Utilizzando l'immagine NIH, tracciare le aree dei due giorni dopo l'amputazione e dei tre giorni dopo l'amputazione di entrambe le metà dorsale e ventrale. Per determinare l'area percentuale di crescita della pinna dorsale rispetto a quella ventrale, utilizzare la seguente formula.

La quantità dorsale tre giorni dopo l'amputazione meno l'amputazione dorsale di due giorni divisa per la quantità ventrale tre giorni dopo l'amputazione meno la ventrale due giorni dopo l'amputazione moltiplicata per 100 è uguale all'area percentuale. Quando si esegue il test per la crescita della pinna tre giorni dopo l'amputazione o 24 ore dopo l'elettroporazione, il morino marcato con fluoresceina deve essere presente nella metà dorsale della pinna. È normale vedere un po' di discesa fino al livello dell'amputazione.

Quando un morfo di controllo viene iniettato nella metà dorsale della pinna, 24 ore dopo l'elettroporazione, si osserva una crescita uguale a quella sul lato ventrale, come mostrato qui. L'iniezione nella metà dorsale della pinna con un morfo sperimentale inibisce la ricrescita su quel lato. Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'immunoistochimica e l'ibridazione C-2, la PCR in tempo reale e l'immunoblotting, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come quali percorsi genetici sono necessari per la rigenerazione.