Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e coltivare neuroni ippocampali altamente purificati da topi prenatali. Questo viene ottenuto isolando e dissezionando prima l'ippocampo dal tessuto di topo embrionale.

Il secondo passaggio della procedura consiste nel dissociare le singole cellule mediante forza meccanica, seguita da trypsinizzazione e attenta triturazione del tessuto cerebrale. Infine, le cellule dissociate vengono contate e coltivate utilizzando mezzo neurobasale e supplemento B27. Neuroni ippocampali purificati in coltura possono essere utilizzati con varie tecniche molecolari come l'immunofluorescenza.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché è difficile immaginare il processo di iterazione. La tendenza è quella di essere troppo energici durante la separazione delle singole cellule dal tessuto cerebrale. È necessaria una dissociazione cellulare generale efficace per completare la procedura di coltura neuronale al fine di ottenere cuccioli prenatali per il reperimento di neuroni.

Programmare l'accoppiamento tra topi adulti 19 giorni prima del giorno di isolamento dei neuroni. L'avvenuto accoppiamento può essere confermato rilevando un tappo vaginale nelle palpitazioni della femmina o mediante conferma visiva della gravidanza il giorno precedente l'isolamento dei neuroni. Per applicazioni di immunofluorescenza, ricoprire coprioggetti di vetro in una piastra a 24 pozzetti con un sottile strato di collagene di coda di ratto in rapporto tre a uno, e soluzione di polilisina uno; distribuire uniformemente la soluzione sul coprioggetto, quindi lasciare le piastre ricoperte scoperte nell'incubatrice a flusso laminare sotto luce UV tutta la notte.

Il giorno successivo, lavare le piastre con HBSS sterile o conservare le piastre fino a una settimana a quattro gradi Celsius al buio. L'immersione in HBSS è fondamentale per questa operazione. Sterilizzare tutti gli strumenti e utilizzare esclusivamente garza sterile prestando particolare attenzione alla tecnica.

La dissezione e il prelievo del tessuto nervoso possono essere eseguiti al di fuori di una cappa a flusso laminare. Iniziare il prelievo del tessuto decapitando il topo gravido a circa 19 giorni post fecondazione. Utilizzando forbici da dissezione e pinzette, creare un'apertura nella parte ventrale mediale del topo per esporre completamente la cavità corporea del topo.

I cuccioli prenatali si troveranno nella parte posteriore della cavità corporea del topo e dovrebbero essere facilmente visibili nell'utero con l'ausilio di pinzette. Aprire l'utero ed estrarre i cuccioli. Decapitare i cuccioli con le forbici e posizionare la testa su una garza sotto un microscopio stereoscopico.

Per aprire il cranio, tagliare con attenzione la cute e il cranio utilizzando un bisturi sterile affilato o forbici da dissezione; rimuovere quindi interamente il cervello con pinze e posizionare il cervello su una garza. Utilizzando un bisturi, rimuovere il cervelletto ed effettuare un'incisione lungo la linea mediana del cervello. Per separarlo in due emisferi, afferrare con le pinze una piccola sezione delle meningi che circondano l'ippocampo e tirarla delicatamente verso l'esterno per facilitare il dissezione dell'ippocampo.

L'ippocampo è una struttura curva che inizia nella parte distale dell'emisfero e si piega ventralmente. Il lato interno concavo è rivolto verso un ventricolo, è il lato codale ed è già libero. Per isolare l'ippocampo, sollevare delicatamente ciascun ippocampo con pinzette da tessuto e trasferirli in una piastra per colture cellulari da 100 millimetri.

Con tre millilitri di HBSS riscaldato sotto una cappa da coltura cellulare, è possibile combinare il tessuto cerebrale di più cuccioli utilizzando tutte le precauzioni sterili possibili. Sotto una cappa a flusso laminare idonea per colture cellulari, utilizzare un bisturi per tritare delicatamente il tessuto cerebrale in HBSS. Trasferire il tessuto tritato e l'HBSS in un tubo conico da 15 millilitri.

Aggiungere 1,5 millilitri di HBSS e 0,5 millilitri di soluzione di tripsina 0,25% fino a un volume totale di cinque millilitri. Chiudere il tubo e capovolgerlo delicatamente quattro o cinque volte. Evitare di produrre bolle, altrimenti il tessuto potrebbe rimanere intrappolato sulla bolla e non sedimentare sul fondo del tubo.

Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Ribaltare il tubo come in precedenza ogni cinque minuti dopo l'incubazione, quindi pipettare con attenzione la soluzione, lasciando il tessuto sul fondo indisturbato. Lavare ora il tessuto con cinque millilitri di HBSS.

Tre volte, lasciare che il tessuto si depositi completamente sul fondo del tubo tra ogni lavaggio e rimuovere con attenzione la soluzione di lavaggio dopo l'ultimo lavaggio. Risospendere il tessuto in due millilitri di HBSS prima di iniziare i passaggi di attivazione. Preparare pipette di Pasteur con estremità arrotondata a fiamma.

Tenere la punta sterile di una pipetta Pasteur lunga nove pollici in una fiamma fino a quando il diametro della pipetta non raggiunge circa 0,5 millimetri e i bordi risultano leggermente arrotondati. Due grandi.

Un'apertura eccessiva renderà la triturazione inefficiente e troppo scarsa. Un'apertura eccessiva danneggia le cellule, quindi si raccomanda cautela nell'uso di una normale pipetta di Pasteur sterile da nove pollici. Triturare delicatamente il tessuto un totale di sette volte.

Se questo processo viene eseguito con troppa energia, le cellule possono subire danni e morire. Lasciare depositare sul fondo del tubo i frammenti di tessuto più grandi prima di passare al passaggio successivo. Trasferire il sopranatante S in un nuovo tubo conico sterile da 50 millilitri contenente il tessuto rimanente.

Aggiungere due millilitri di HBSS sterile e tritare un totale di cinque volte utilizzando una pipetta Pasteur flame-polished. Lasciare depositare sul fondo del tubo tutti i frammenti di tessuto rimanenti e combinare il surnatante con il surnatante precedente per un volume totale di quattro millilitri.

Conta le cellule neuronali dissociate utilizzando un emocitometro. Come regola generale, una volta determinato il numero di cellule, sottrarre il 20% da questo valore finale per tenere conto di eventuali morti cellulari che potrebbero verificarsi. Dopo il seeding, mescolare le cellule con il mezzo di coltura neurobasale per 24.

Preparare le piastre in modo da aggiungere 60.000 cellule per pozzetto in 0,5 millilitri di terreno per piastre di coltura da 60 millimetri. Preparare l'aggiunta di 400.000 cellule in tre millilitri di terreno per piastre di coltura da 100 millimetri. Preparare l'aggiunta di 6 milioni di cellule in sei millilitri di terreno, agitando delicatamente le piastre per distribuire le cellule in modo uniforme.

Collocare i neuroni in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tutta la notte. Il giorno successivo, rimuovere metà del volume di mezzo dalle cellule e sostituirlo con lo stesso volume di mezzo di alimentazione neurobasale. A differenza del mezzo di semina, questo mezzo non contiene glutammato né alto contenuto di siero equino.

I neuroni in coltura devono essere alimentati ogni quattro giorni rimuovendo metà del vecchio mezzo e sostituendolo con lo stesso volume di mezzo fresco per l'alimentazione neurobasale. I processi neuronali dovrebbero iniziare a essere visibili già dal primo giorno e diventare estesi e ramificati entro il giorno 10. A volte può verificarsi una contaminazione da cellule gliali.

Si distinguono facilmente dai neuroni in coltura e, in questo caso, rendono difficile l'analisi e la visualizzazione del processo neuronale che esprime A GFP lc three; pertanto, per ridurre la contaminazione da cellule gliali, trattare la coltura con citosina arabinoside prima del quarto giorno di coltura alla dose più bassa efficace. Se la coltura è contaminata da cellule microgliali reattive di tipo fibroblastico, trattarla con FRDR per ridurne la proporzione.

I neuroni dell'ippocampo sono stati coltivati per sette giorni e colorati con un colorante vitale per evidenziare i mitocondri attivi e le cellule in coltura. Le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% in PBS e visualizzate mediante microscopia fluorescente. Il colorante stesso non è fluorescente fino a quando non viene ossidato all'interno dei mitocondri.

Mitochondri attivi possono essere osservati lungo tutti i processi neuronali. Le cellule della coltura a sette giorni sono state inoltre fissate con paraformaldeide al 4% in PBS e sottoposte a immunomarcatura con anticorpo monoclonale anti-tubulina, seguito da anticorpo secondario caprino anti-US marcati con verde Oregon, e la fluorescenza è stata visualizzata mediante microscopia. Colture neuronali di ippocampo sono state coltivate per cinque giorni e trasfettate con il costrutto di DNA G FP lc tre beta utilizzando lipofezione in 2000.

Al settimo giorno, le cellule sono state fissate utilizzando paraformaldeide al 4%, PBS e MICROSOMI con lc tre beta marcata con GFP incorporata nella loro membrana esterna, che sono state visualizzate mediante microscopia a fluorescenza. Gli acrosomi si trovano in tutto il corpo cellulare e nei neuriti e sono indicati con frecce. Durante il tentativo di eseguire questo protocollo, è importante ricordare di effettuare la procedura rapidamente ma con attenzione, trattando delicatamente le cellule durante il processo di iterazione. Prestare attenzione a queste variabili migliorerà notevolmente la capacità di coltivare con successo.

Neuroni ippocampali di topo.