Preparazione di sezioni parasagittali delle inchieste sui dorso-ventrale organizzazione della corteccia entorinale Rodent mediale

Si descrivono procedure di preparazione e registrazione elettrofisiologica da fette di cervello che mantengono il dorso-ventrale asse mediale corteccia entorinale (MEC). A causa di codifica neurale della posizione segue un dorso-ventrale organizzazione all'interno della MEC, queste procedure di facilitare studio dei meccanismi cellulari importanti per la navigazione e la memoria.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esaminare l'organizzazione topografica delle proprietà sinaptiche e integrative dei neuroni nella corteccia RH mediale. Ciò si ottiene preparando fette di corteccia destra mediale orientate su un piano ventrale dorsale. Come seconda fase, le registrazioni di patch clamp vengono effettuate tramite i neuroni della corteccia RH per studiare le loro proprietà sinaptiche e integrative.

Successivamente, viene determinata la posizione del neurone registrato per valutare l'organizzazione ventrale dorsale delle proprietà elettrofisiologiche misurate. Si ottengono risultati che mostrano l'organizzazione topografica delle proprietà intrinseche delle cellule stellate nel secondo strato in base alle misure della loro resistenza di ingresso, della costante di tempo di membrana e della soglia del potenziale d'azione, a dimostrare la procedura sarà Hugh Pastel, uno studente laureato del mio laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le fette di cervello orientate orizzontalmente, è che la posizione del neurone registrato lungo l'asse ventrale dorsale della corteccia interale può essere registrata con precisione.

Per iniziare questa procedura, rimuovere il cervello dal topo e metterlo immediatamente in taglio a freddo. Liquido spinale cerebrale artificiale gorgogliato con carbogeno. Dopo tre minuti, rimuovere con cautela il cervello dalla talea A CSF usando una spatola.

Posizionarlo delicatamente in posizione verticale sulla carta da filtro che è stata inumidita con il taglio di A CSF. Quindi usa un rasoio o un bisturi per rimuovere il più possibile il cervelletto senza colpire la corteccia enterale mediale, che si trova all'estremità cordale del cervello. Rimuovere la parte rostrale del cervello sezionando il piano coronale.

Successivamente hemis sec, il cervello sul piano verticale della linea mediana. Dopodiché, rimettere gli emisferi nella bolla tagliando un liquido cerebrospinale per un minuto e mezzo prima di montare. Assicurarsi che il tagliente della lama del vibrato sia angolato di 20 gradi rispetto all'orizzontale Sulla superficie di montaggio, fare una striscia poco profonda di super colla parallela alla lama del vibrato, all'incirca della larghezza di un emisfero e abbastanza lunga da ospitare i due emisferi da un capo all'altro.

Quindi trasferire ogni emisfero dal taglio di un liquido cerebrospinale alla superficie di montaggio posizionando l'emisfero in modo che la sua superficie mediale poggi sulla spatola e la sua estensione dorsale sia rivolta verso la lama del tono vibrante. Far scorrere delicatamente l'emisfero sulla striscia di super colla e assicurarsi che la superficie mediale di ogni emisfero sia parallela alla base del vibrato. Successivamente, immergere immediatamente gli emisferi nel taglio a freddo.

Un liquido cerebrospinale. Mantenere la temperatura, l'auto e la saturazione durante tutta la procedura di affettatura. Con il vibram, rimuovere le cortecce da entrambi gli emisferi nel piano sagittale fino a quando la parte più laterale della corteccia enterale mediale in ciascun emisfero non viene identificata ad almeno 600 micrometri dalla superficie laterale.

L'estensione laterale della corteccia enterale mediale è identificata dall'assenza della spessa banda bianca attorno alla curva cordale ventrale dell'ippocampo. La forma non convessa del suo confine rostrale e l'angolo angolare del cordale dorsale tagliano 400 micron di sezioni para sagittali da entrambi gli emisferi fino a raggiungere l'estensione mediale della corteccia enterale mediale. Dopo ogni taglio, porre immediatamente le fette nel liquido cerebrospinale standard A saturo di carbogeno mantenuto a bagnomaria a 35 gradi Celsius e incubarle per circa 15 minuti.

Dopo 15 minuti, togliere il portafette dal bagnomaria e continuare a gorgogliare con carbogeno a temperatura ambiente per almeno 45 minuti. Trasferire una fetta nella camera di registrazione, che viene continuamente gorgogliata con standard A-C-S-F-A saturo di carbogeno a 35 gradi Celsius. Successivamente, identificare una regione di registrazione approssimativa all'interno della corteccia RH mediale.

Quindi passa a un obiettivo ad alto ingrandimento. Identificare le cellule vitali all'interno di questa regione. A questo punto, è possibile eseguire esperimenti che utilizzano il convenzionale patch clamp a cellula intera per registrare il potenziale di membrana o la corrente di membrana dai neuroni identificati.

L'identità del neurone può essere verificata dalle proprietà elettrofisiologiche del neurone registrato e includendo etichette fluorescenti all'interno della soluzione intracellulare. Dopo l'esperimento per determinare la posizione di un neurone registrato lungo l'asse ventrale dorsale, passare a un obiettivo a basso ingrandimento. Contrassegnare la posizione di interesse includendo l'elettrodo di registrazione in un'immagine o abbassando il diaframma a iride di campo.

Per lasciare un cerchio luminoso attorno alla posizione di interesse in un'immagine duplicata, la regione mediale e la corteccia RH e le aree circostanti della fetta per individuare la posizione di registrazione all'interno dell'immagine, il duplicato può quindi essere sovrapposto all'immagine iniziale della posizione di registrazione e dei suoi dintorni. Possono essere necessarie fino a tre immagini separate a basso ingrandimento per coprire l'area da una posizione di registrazione ventrale al bordo dorsale della corteccia interale mediale. Queste immagini possono quindi essere unite utilizzando un software di manipolazione delle immagini.

Il bordo dorsale della corteccia enterale mediale fornisce un comodo punto di riferimento per misurare la posizione ventrale dorsale, ma il bordo ventrale della corteccia enterale mediale non è così ben definito. Qui. Le sezioni DIC e NIAL para sagittale mostrano rispettivamente l'ippocampo circolare e la mancanza di una sporgenza para orbicolare nello strato uno della corteccia enterale laterale. Si tratta di immagini delle tipiche fette che contengono la corteccia enterale mediale.

L'area dei paras è chiaramente rivelata dalla colorazione del missile. Nelle immagini corrispondenti, il bordo dorsale della corteccia enterale mediale indicato dalla freccia nera è ventrale rispetto al gruppo di cellule para orbicolari che sporge molto nello strato uno come indicato dalla freccia rossa. Ecco un esempio di un'immagine composita con ingrandimento quattro volte di una fetta para sagittale.

Le posizioni di una cellula dorsale e di una cellula ventrale sono indicate rispettivamente da cerchi pieni blu e verdi. La freccia nera segna il bordo dorsale stimato della corteccia interale mediale ed è estesa negli strati profondi dalla linea tratteggiata bianca. La linea bianca continua è una guida che mostra il percorso del contorno, lungo il quale viene mostrata la misurazione dei pixel della distanza dal bordo dorsale della corteccia interna mediale alle registrazioni cellulari localizzate ventralmente dalle cellule stellate dorsali e ventrali marcate.

Queste registrazioni aiutano a stabilire l'identità delle cellule e illustrano come le proprietà elettriche della corteccia interna mediale. Le cellule stellate del secondo strato differiscono nelle posizioni dorsale e ventrale durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di prestare la massima attenzione durante la preparazione delle sezioni, poiché le fette di alta qualità sono essenziali per registrazioni elettrofisiologiche produttive.