Name: Preparazione di sezioni parasagittali delle inchieste sui dorso-ventrale organizzazione della corteccia entorinale Rodent mediale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Impara a preparare sezioni parasagittali della corteccia entorinale mediale per studiare l'organizzazione dorso-ventrale dei neuroni stellati. Questo metodo elettrofisiologico consente di analizzare le proprietà intrinseche delle cellule e le loro variazioni topografiche lungo l'asse dorsale-ventrale.

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Siamo ringraziare per il loro sostegno: Commonwealth Scholarship Commissione UK finanziamento (HP), EPSRC (HP), BBSRC (NPF) e dell&#39;Unione europea Azioni Marie Curie (NPF).

1. Slice Preparazione parasagittale 1,1 Dissect out emisferi cerebrali Tutti sperimentazione animale dovrebbero seguire locali esame etico e delle normative nazionali. Nel caso degli esperimenti descritti qui, il lavoro conforme agli animali Regno Unito (Scientific Procedures) Act 1986. Noi abitualmente uso dislocazione cervicale senza anestesia per eutanasia il mouse prima di rimuovere il cervello. In alternativa, il mouse può essere terminale anestetizzati, ma in questo caso può essere necessario per determinare se la scelta di anestetico influenza proprietà neuronali. Togliere il cervello dal mouse e subito posto in condizioni di freddo (4-8 ° C) il taglio artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) (vedi Tabella 1 per composizioni in soluzione) bollito alla saturazione con CarboGen (95% O 2, 5% CO 2). Dopo un massimo di tre minuti, rimuovere con attenzione il cervello dal cUtting ACSF utilizzando una spatola e delicatamente collocare in posizione verticale (lato dorsale verso l&#39;alto) su carta da filtro che è stato inumidito con il taglio ACSF (Figura 1A). Per facilitare il montaggio accurato degli emisferi, utilizzare un rasoio o bisturi per rimuovere la maggior quantità del cervelletto possibile senza ripercussioni sul MEC (che si trova all&#39;estremo caudale del cervello) e rimuovere il terzo rostrale del cervello sezionando nel piano coronale (figura 1B). Hemisect il cervello, avendo cura che la sezione è esattamente lungo il piano verticale della linea mediana (Figura 1C). Ritorno degli emisferi al ACSF bolle di taglio per un minuti e mezzo. 1,2 Montare gli emisferi su un vibratomo Prima del montaggio, in modo che il bordo tagliente della lama vibratomo è angolato a 20 gradi dalla posizione orizzontale ( <sTrong&gt; Figura 1D). Sulla superficie di montaggio una striscia superficiale di colla parallela alla lama vibratomo, circa la larghezza di un emisfero e sufficientemente lunga per i due emisferi end-to-end. Avendo cura di minimizzare l&#39;impatto fisico, rimuovere ciascun emisfero dalla ACSF taglio con una spatola e la posizione in modo che la sua superficie mediale si basa sulla spatola e la sua estensione dorsale rivolta verso la lama microtomo. Delicatamente ciascun emisfero sulla striscia di colla, avendo cura di assicurare che la superficie mediale di ciascun emisfero è parallelo alla base microtomo. Abbiamo trovato che i migliori risultati per la superficie dorsale di ciascun emisfero dovrebbe essere parallelo e rivolte verso la lama vibratomo (Figura 1D). 1.3 Manutenzione del preparato durante l&#39;affettatura Dopo il montaggio immediatamente immergere gli emisferi in ACSF taglio a freddo (4 - 8 ° C). Mantenere la temperature saturazione e CarboGen tutta la procedura di taglio. Se il raffreddamento diretto e gorgogliamento della soluzione nella camera di taglio non è pratico, periodicamente ricostituire la soluzione di taglio ACSF nella camera con soluzione fresca raffreddato e bolle. 1.4 sezioni tagliate Utilizzando un vibratomo, rimuovere corteccia da due emisferi nel piano sagittale fino a identificare l&#39;estensione più laterale del MEC (tipicamente ~ 1 millimetro dalla superficie laterale) (figura 1F). Tra tagli sollevare la lama vibratomo up ~ 200 micron per evitare di trascinare la lama ripercorrere e danneggiare il tessuto esposto. Contemporaneamente tagliate sezioni 400 um parasagittali da due emisferi (se sono allineate, come mostrato nella figura 1D saranno entrambi essere tagliate contemporaneamente) finché la portata mediale del MEC viene raggiunto. Questo può essere identificato tramite l&#39;assenza della banda bianca spessa attorno al ventro-caudale curva di tegli ippocampo (la capsula esterna), la non-convessa del suo confine rostrale e l&#39;angolare dorso-caudale &#39;angolo&#39;. figura 1E illustra l&#39;aspetto circolare dell&#39;ippocampo nel piano parasagittale laterale al MEC. figure 1F-G illustrano come sezioni all&#39;interno del MEC appaiono in diverse laterale-mediale posizioni quando taglio. Nota la progressivamente più a forma di fagiolo aspetto dell&#39;ippocampo da più posizioni mediale. Ogni emisfero produce in genere due o tre fette di 400 micron di spessore che contengono il MEC. 1.5 fette Incubare Dopo ogni taglio immediatamente disporre le fette in CarboGen-saturo standard di ACSF mantenuti in un bagno di acqua a 35 ° C. Lasciare fette a incubare a 35 ° C per circa 15 minuti nel ACSF dopo il taglio è completa. Rimuovere il supporto fetta dal bagnomaria e continuare a gorgogliare con CarboGen a temperatura ambiente per lest 45 minuti. 2. Esempio parasagittale Experiment Slice Un tipico esperimento utilizzando questa preparazione è quello di rendere le registrazioni elettrofisiologiche da parte delle cellule stellate nel livello II della MEC. 2.1 Ottimizzare ottiche Prima della registrazione, in modo che il condensatore è a fuoco sul piano slice (illuminazione Koehler) ed è centrato sotto l&#39;ingrandimento elevato (ad esempio 40x) obiettivo. 2.2 identificare le cellule di interesse Utilizzare un basso ingrandimento (es. 4x) obiettivo per identificare una regione approssimativo di registrazione all&#39;interno del MEC (Figura 2A-B). Passare a un obiettivo ingrandimento per identificare cellule vitali all&#39;interno di questa regione (Figura 2C-D). Come esempio, putativi strato II cellule stellate sono visivamente identificati dai loro forma poligonale o ovoidale e più dendriti primari con diametro simileter, e l&#39;assenza di un diametro unico grande dendrite apicale 2,13,14. Essi vengono identificati sul bordo del bordo Layer I / II, dove sono abbondanti e spesso appaiono in piccoli gruppi 2,9 (Figura 2C-D). Altri tipi di cellule, quali interneuroni e cellule piramidali dovrebbero anche essere identificabile. A questo punto esperimenti può essere effettuata, per esempio utilizzando whole-cell patch-clamp per registrare il potenziale di membrana o di membrana corrente da neuroni identificati, e metodi elettrici o optogenetic per attivare gli ingressi sinaptiche al neurone registrato. Neuron identità può essere verificata dalle proprietà elettrofisiologiche dei neuroni registrati e includendo le etichette fluorescenti all&#39;interno della soluzione intracellulare. 3. Misurare posizione lungo il dorso-ventrale Axis 3,1 posizione dell&#39;immagine di interesse e slice circostante Per determinare la posizione di un regineurone DED lungo il dorso-ventrale asse, utilizzare innanzitutto un obiettivo a basso ingrandimento per l&#39;immagine della regione MEC della fetta e le zone circostanti. Segnare la posizione di interesse, ad esempio, tra l&#39;elettrodo di registrazione in una immagine (Figura 3A) o scendendo il diaframma di campo e lascia un cerchio luminoso intorno alla posizione di interesse in una copia dell&#39;immagine. Per individuare la posizione di registrazione all&#39;interno dell&#39;immagine del duplicato può essere sovrapposta all&#39;immagine iniziale della posizione di registrazione e dei suoi dintorni (Figura 3B). Fino a 3 ingrandimenti separata bassa (4x) immagini può essere necessario per coprire l&#39;area da una posizione di registrazione ventrale al confine dorsale del MEC. Queste immagini possono poi essere unite insieme mediante manipolazione delle immagini software per fornire un&#39;immagine che le misure di distanza può essere presa da (Figura 3). Ulteriore verifica dell&#39;identità neurone e localizzazione può essere effettuata seguendo registrazione includendomarcatori inattivi come coloranti o biocitina Alexa all&#39;interno della soluzione intracellulare e quindi utilizzando opportune elaborazioni del tessuto in seguito registrazione 2. 3,2 Stabilire il confine dorsale del MEC Il bordo dorsale del MEC fornisce un punto di riferimento da cui partire per misurare la posizione dorso-ventrale. Il bordo ventrale del MEC non è ben definito. La figura 4 mostra come i punti di riferimento definiti nel MEC cellulari Nissl fette colorate a differenti posizioni di medio-laterale appaiono sotto illuminazione DIC. Figura 4 A mostra l&#39;ippocampo circolare (figura 4 (i)) e la mancanza di una sporgenza parasubicular strato in I (Figura 4 (iv)) associato con fette parasagittali contenenti laterale corteccia entorinale (LEC). Figura 4 aC mostrano fette tipici che contengono la MEC. La parte dorsale del promontorio scuro dorsale entorinale / Parasubicular regione di confine nelle fette DIC illuminati contiene un&#39;area del parasubiculum. L&#39;area parasubiculum è chiaramente rivelata mediante colorazione Nissl nelle immagini corrispondenti a colonna (iii). Il bordo dorsale delle MEC (frecce nere in 4B e 4C colonna (iv)) è ventrale al gruppo di celle parasubicular che sporge in profondità nello strato I (frecce rosse 4B e 4C colonna (iv)). Confronto delle figure 4B e 4C colonne (ii) e (iii) mostra che il bordo dorsale del MEC nelle sezioni Nissl corrisponde a una posizione che è ventrale al bordo dorsale del buio entorinale / Parasubicular regione di confine nella fetta DIC ( frecce nere). La posizione del bordo può essere stimata dalle immagini DIC e di confronto per immagini di riferimento (vedi anche rif. 14). Future convalida del confine dorsale MEC con marcatori molecolari migliorerà l&#39;accuratezza di questa stima. Notiamo that macchiato sezioni di riferimento, e le sezioni che vengono elaborati per l&#39;identificazione morfologica di neuroni marcati, può essere soggetto a restringimento considerevole. Confronto delle distanze relative a punti di riferimento assoluti in DIC sezioni di riferimento e quindi richiede prima misurazione e della correzione per il ritiro (si veda per esempio rif 2). 3,3 Calibrare e misurare le distanze Per agevolare una facile misurazione della distanza in immagini, utilizzare lo stesso obiettivo a basso ingrandimento di immagine una griglia di riferimento per stabilire un pixel: conversione del rapporto a distanza. Misurare la distanza pixel dal bordo dorsale della MEC alla posizione di interesse lungo il contorno della MEC utilizzando un programma di grafica e convertire distanza pixel a distanza in um (figura 5A). Se i neuroni sono riempiti con un marcatore come biocitina, allora posizione del neurone registrato può anche essere recuperato dal trattamento appropriato (per esempio vedi riferimento 2). 4. ReprRisultati esentative Figura 5A mostra un esempio basso ingrandimento (4x) immagine composita di una fetta parasagittale dopo la registrazione, con le posizioni di neuroni registrati e guide misurazione sovrapposti. Registrazioni dalle cellule marcate stellate dorsale e ventrale sono mostrati in figura 5B. Queste registrazioni aiutare a stabilire l&#39;identità delle cellule ed illustrare come le proprietà elettriche del MEC Layer II cellule stellate differiscono in luoghi dorsali e ventrali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig1.jpg" /> Figura 1. Preparazione di fette parasagittali. Un cervello intero riposo con il lato dorsale verso l&#39;alto su carta da filtro inumidita con taglio ACSF. B </sTrong&gt; Cervello dopo la rimozione del cervelletto e del terzo rostrale della corteccia frontale. cerebrale C Hemisected pronto per il montaggio. D montato emisferi striscia adesiva parallelamente al tagliente della lama vibratomo prima immersione nel taglio ACSF e affettare. E aspetto di sezione contenente LEC durante Aspetto taglio procedura dopo la rimozione di tessuto laterale e non ancora sufficientemente mediale per uno standard fetta parasagittale MEC. F della parte &#39;laterale&#39; del MEC dopo la rimozione di ulteriori 400 micron di tessuto (la superficie è di 400 um mediale a quello illustrato nella . (F)) Aspetto G della parte &#39;mediale&#39; del MEC, dopo una fetta di 400 micron parasagittale è stato tagliato HI Schema di EF, rispettivamente, indicano punti di repere anatomici, C:. cervelletto, L: laterale della corteccia entorinale (LEC), m: mediale corteccia entorinale (MEC), h: ippocampo, arancione: capsula esterna, blu: corpo calloso, ciano: giro dentato, green: CA3 e CA1. L&#39;aspetto di confine rostrale dell&#39;ippocampo a fette che contengono LEC è concava (freccia nera in H), mentre a fette che contengono solo MEC, il confine può essere lineare (freccia rossa in I) o concave (freccia rossa in J). Le forme approssimative di punti di repere anatomici colorati sono stati ricavati dalle annotazioni nel cervello Allen Atlas ( <a href="http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html">http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html</a> ). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig2.jpg" /> Figura 2. Identificare le cellule dello strato MEC II sotto illuminazione DIC. Una immagine composita Esempio di para<html> sezione sagittale del cervello a basso ingrandimento (4x). Le immagini separate sono state allineate e miscelati per rimuovere i bordi di distrazione e vignettatura. Importante punto di riferimento h aree: l&#39;ippocampo, m. MEC B Crop da un individuo a basso ingrandimento (4x) un&#39;immagine che contiene strato II del MEC, visibile come la striscia scura verticale vicino al bordo destro C MEC II livello a forte ingrandimento (. ) 40x con illuminazione DIC. L&#39;immagine è un composito allineata e mescolato di più immagini. Il denso centrale &#39;colonna&#39; di cellule è Layer II. D singola immagine ad alto ingrandimento DIC mostra un gruppo di cellule stellate presunti sani e interneuroni dello strato II. Come si vede qui, le cellule stellate si verificano spesso in gruppi al confine dello strato I / II. Cellule piramidali tendono a trovare più vicino al II / III confine Layer. Le linee tratteggiate in AC indicano il grado di BD, rispettivamente. Barre di scala: in A e B 500 pm, in C e D 100 micron. Figura 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. La misurazione del dorso-ventrale posizione di luoghi di interesse. Un ingrandimento Allineato bassa (4x) immagini che includono l&#39;intero dorso-ventrale entità del MEC tra la posizione di interesse (contrassegnato dalla punta di un elettrodo di registrazione) e al buio entorinale / Parasubicular riferimento zona di confine (utilizzato per stabilire il bordo dorsale del MEC - vedi figura 4) B come in A, ma con una immagine sovrapposta con una bloccata sul campo di diaframma ad iride (sovrapposti con opacità ridotta) invece di un elettrodo di registrazione per contrassegnare la posizione di interesse.. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig4.jpg" /> Figura 4. La stima del bordo dorsale della MEC dalle immagini DIC di fette parasagittali. AC sezioni parasagittale (laterale a mediale) dalla corteccia entorinale. Sezioni DIC e Nissl sono da mic diversie colonna AC (i):.. intere fette parasagittali (400 micron di spessore) (allineati e composti misti di basso ingrandimento (4x) immagini) colonna AC (ii): Primo piano di corteccia entorinale con il colore scuro, caratteristica entorinale / Parasubicular regione di confine in la zona superiore di ogni immagine. AC colonna (iii) Nissl fette colorate (40 micron di spessore) da un mouse diverso allineato con le immagini in AC (ii). Il più scuro, denso strato di cellule è lo strato II. Confronto colonne (ii) e (iii) mostra come le cellule colorate Nissl apparire nelle immagini DIC colonna AC (iv):. Dettaglio di Nissl fette colorate. Colonna B e C (iv) includono cellule dal parasubiculum (parte dorsale del buio entorinale / Parasubicular regione di confine nelle immagini DIC) e cellule di MEC dorsale. In B (iv) e C (iv) la patch grande dorsale di cellule parasubicular che si estende in profondità nel layer I è facilmente visibile (frecce rosse). Il bordo ventrale di queste patch corrisponde alla dorsale border del MEC (frecce nere). In A (iv) la patch parasubicular è assente, indicando che la fetta è troppo laterale per una preparazione standard parasagittale fetta MEC. In tutti i pannelli, frecce nere indicano il confine dorsale del MEC. Frecce grigie indicano il confine approssimativa ventrale del MEC. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig5.jpg" /> Figura 5. Risultati rappresentativi. Una porzione ritagliata e Blended dell&#39;immagine in Figura 3 A. Le posizioni di una cella dorsale e una cellula ventrale sono indicati con blu e verdi cerchi pieni rispettivamente. La freccia nera segna il confine stimato dorsale del MEC e si estende negli strati profondi dalla linea bianca tratteggiata. La linea solido bianco un breve mostra il percorso di contorno lungo il quale è stata presa la misurazione pixel di distanza dal bordo dorsale della MEC alla cella posizione ventrale. Barra della scala: 500 micron B Electro.tracce fisiologiche le cellule indicate in A. Da sinistra a destra - le risposte sottosoglia alle operazioni correnti utilizzati per calcolare la resistenza di ingresso, spike risposta ad un grande passo positivo attuale, particolare picco.

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</ol>

Niente da rivelare.

Per facilitare studio di proprietà del circuito MEC che seguono un dorso-ventrale organizzazione che abbiamo descritto in dettaglio una procedura per la produzione di una preparazione parasagittale sezione che conserva il dorso-ventrale entità del MEC. Passaggi critici Rimozione del cervello dell&#39;animale. Prestare particolare attenzione per evitare di esercitare pressione sul cervello. Questo è più importante rapida rimozione del cervello. <...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Taglio ACSF (mM) </td><td> ACSF standard (mM) </td><td> Soluzione interna (mm) </td><td> CASNumber </td><td> Fornitore Numero di catalogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 86 </td><td> 124 </td><td></td><td> 7647-14-5 </td><td> Sigma S9888 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td></td><td> 13472-35-0 </td><td> Sigma 71505 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 </td><td> 2,5 </td><td> 10 </td><td> 7447-40-7 </td><td> Sigma P3911 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td></td><td> 144-55-8 </td><td> Fischer S/4240 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 25 </td><td> 20 </td><td></td><td> 50-99-7 </td><td> Sigma G5767 </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> 75 </td><td></td><td></td><td> 57-50-1 </td><td> Sigma S5016 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 </td><td> 2 </td><td></td><td> 10043-52-4 </td><td> VWR 190464K </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 7786-30-3 </td><td> Sigma 63020 </td></tr><tr><td> K Gluconato </td><td></td><td></td><td> 130 </td><td> 299-27-4 </td><td> Sigma G4500 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 7365-45-9 </td><td> Sigma H3375 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0,1 </td><td> 67-42-5 </td><td> Sigma E4378 </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td> 34369-07-8 </td><td> Sigma A7699 </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td></td><td></td><td> 0,3 </td><td> 36051-31-7 </td><td> Sigma G8877 </td></tr><tr><td> NaPhospho-Creatina </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 19333-65-4 </td><td> Sigma P7936 </td></tr><tr><td> Biocitina (opzionale) </td><td></td><td></td><td> 2,7 </td><td> 576-19-2 </td><td&gt; Sigma B4261 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Taglio ACSF, standard ACSF e K-gluconato ricette soluzione interna.

preparazione di sezioni parasagittali delle inchieste sui dorso-ventrale organizzazione della corteccia entorinale rodent mediale

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Calcolo nel cervello si basa su neuroni che rispondono in modo appropriato ai rispettivi ingressi sinaptici. I neuroni si differenziano per il loro complemento e distribuzione di canali ionici della membrana che determinano il modo in cui rispondono agli ingressi sinaptici. Tuttavia, il rapporto tra queste proprietà cellulari e la funzione neuronale in comportamenti animali non è ben compreso. Un approccio a questo problema è di investigare topograficamente organizzati circuiti neurali in cui la posizione dei singoli neuroni mappe su informazioni che codificano o calcoli essi effettuati 1. Gli esperimenti che utilizzano questo approccio suggeriscono i principi per l&#39;ottimizzazione della risposta sinaptica alla base codifica dell&#39;informazione nei circuiti sensoriali e cognitive 2,3. L&#39;organizzazione topografica delle rappresentazioni spaziali lungo l&#39;asse dorso-ventrale della corteccia entorinale mediale (MEC) fornisce l&#39;opportunità di stabilire relazioni tra i meccanismi cellulari e calcoli importante per la cognizione spaziale. I neuroni nello strato II del MEC roditore posizione utilizzando la codifica di tipo grid cottura campi 4-6. Per neuroni trovati in posizioni dorsali in MEC la distanza tra i singoli campi di cottura che formano una griglia è dell&#39;ordine di 30 cm, mentre per i neuroni in posizioni progressivamente più ventrali questa distanza aumenta a maggiore di 1 m. Diversi studi hanno rivelato proprietà cellulari di neuroni strato II del MEC che, come la spaziatura tra i campi della griglia di cottura, anche differire a seconda delle dorso-ventrale posizione, suggerendo che queste proprietà cellulari sono importanti per il calcolo spaziale 2,7-10. Qui si descrivono le modalità di preparazione e registrazione elettrofisiologica di fettine di cervello che mantengono la dorsale-ventrale l&#39;ampiezza delle investigazioni MEC consente l&#39;organizzazione topografica delle proprietà biofisiche e anatomiche dei neuroni MEC. Il dorso-ventrale posizione di n identificatoeurons relativi punti di riferimento anatomici è difficile stabilire con precisione con protocolli che utilizzano fette orizzontali di MEC 7,8,11,12, poiché è difficile stabilire punti di riferimento per l&#39;esatto dorso-ventrale posizione della fetta. Le procedure che descrivono consentono la misurazione accurata e coerente di localizzazione delle cellule registrate lungo l&#39;asse dorso-ventrale del MEC, nonché la visualizzazione dei gradienti molecolari 2,10. Le procedure sono state sviluppate per l&#39;utilizzo con topi adulti (&gt; 28 giorni) e sono stati impiegati con successo con i topi fino a 1,5 anni. Con aggiustamenti potrebbero essere utilizzati con più giovani topi o altre specie di roditori. Un sistema standardizzato di preparazione e misura aiuterà un&#39;indagine sistematica delle proprietà cellulari e microcircuito di questa zona.

Si descrivono procedure di preparazione e registrazione elettrofisiologica da fette di cervello che mantengono il dorso-ventrale asse mediale corteccia entorinale (MEC). A causa di codifica neurale della posizione segue un dorso-ventrale organizzazione all&#39;interno della MEC, queste procedure di facilitare studio dei meccanismi cellulari importanti per la navigazione e la memoria.

Preparazione di sezioni parasagittali delle inchieste sui dorso-ventrale organizzazione della corteccia entorinale Rodent mediale

Il calcolo nel cervello si basa sulla capacità dei neuroni di rispondere in modo appropriato ai loro input sinaptici. I neuroni differiscono per il complemento e la distribuzione di...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare l'organizzazione topografica delle proprietà sinaptiche e integrative dei neuroni nella corteccia mediale enter RH. Questo viene ottenuto preparando sezioni della corteccia mediale enter RH orientate in un piano dorso-ventrale. Come secondo passaggio, vengono effettuate registrazioni con tecnica del patch clamp su neuroni della corteccia mento RH per studiare le loro proprietà sinaptiche e integrative.Successivamente, viene determinata la posizione del neurone registrato per valutare l'organizzazione dorso-ventrale delle proprietà misurate elettrofisiologicamente. Si ottengono risultati che mostrano l'organizzazione topografica delle proprietà intrinseche delle cellule stellate nel secondo strato, basata sulle misurazioni della loro resistenza di ingresso, della costante di tempo della membrana e della soglia del potenziale d'azione. Il procedimento sarà dimostrato da Hugh Pastel, uno studente laureato del mio laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come ad esempio sezioni cerebrali orientate in senso orizzontale, è che la posizione del neurone registrato lungo l'asse dorso-ventrale della corteccia entorinale può essere registrata con precisione.Per iniziare questa procedura, rimuovere il cervello dal topo e posizionarlo immediatamente in una soluzione fredda di liquido cerebrospinale artificiale saturata con carbogeno. Dopo tre minuti, rimuovere con attenzione il cervello dalla soluzione di taglio utilizzando una spatola.Posizionarlo delicatamente in posizione verticale sulla carta filtro che è stata inumidita con A CSF. Quindi utilizzare un rasoio o un bisturi per rimuovere la maggior parte possibile del cervelletto senza danneggiare la corteccia entorinale mediale, situata all'estremità cordale del cervello. Rimuovere la parte rostrale del cervello sezionando nel piano coronale.Successivamente, tagliare in senso emisferico il cervello lungo il piano verticale della linea mediana. Dopodiché, reinserire gli emisferi nella soluzione di liquido cefalorachidiano ossigenata per un minuto e mezzo prima del montaggio. Assicurarsi che il bordo tagliente della lama del vibratomo sia inclinato di 20 gradi rispetto all'orizzontale. Sulla superficie di montaggio, applicare una sottile striscia di colla cianoacrilica parallela alla lama del vibratomo, di larghezza approssimativamente uguale a quella di un emisfero e abbastanza lunga da contenere i due emisferi disposti uno accanto all'altro.Quindi trasferire ciascun emisfero dal taglio del LCS alla superficie di montaggio posizionando l'emisfero in modo che la sua superficie mediale poggia sulla spatola e la sua estensione dorsale sia rivolta verso la lama del vibratome. Far scivolare delicatamente l'emisfero sulla striscia di colla cianoacrilica e assicurarsi che la superficie mediale di ciascun emisfero sia parallela alla base del vibratome. Successivamente, immergere immediatamente gli emisferi nel liquido di taglio freddo.Un CSF. Mantenere la temperatura, la concentrazione di ossigeno e la saturazione durante tutta la procedura di taglio. Con il vibromicrotomo, rimuovere le cortecce da entrambi gli emisferi nel piano sagittale fino a quando non si identifica la parte più laterale della corteccia entorinale mediale in ciascun emisfero, posizionata ad almeno 600 micrometri dalla superficie laterale.L'estensione laterale della corteccia entorinale mediale viene identificata dall'assenza della spessa banda bianca attorno alla curva cordale ventrale dell'ippocampo. A partire dalla forma non convessa del suo confine rostrale e dall'angolo dorsale cordale angoloso, si effettuano sezioni parasagittali di 400 micron da entrambi gli emisferi fino a raggiungere l'estensione mediale della corteccia entorinale mediale. Dopo ogni taglio, si posizionano immediatamente le fette in soluzione fisiologica A standard satura di carbogeno, mantenuta in un bagno ad acqua a 35 gradi Celsius, e si incubano per circa 15 minuti.Dopo 15 minuti, rimuovere il portatessere dal bagno a bagno-maria e continuare a far passare carbogeno a temperatura ambiente per almeno 45 minuti. Trasferire una sezione nella camera di registrazione, che viene continuamente saturata con A-C-S-F-A standard arricchito di carbogeno a 35 gradi Celsius. Successivamente, identificare una regione di registrazione approssimativa all'interno della corteccia entorinale mediale.Quindi passare a un obiettivo ad alto ingrandimento. Identificare le cellule vitali all'interno di questa regione. A questo punto, è possibile eseguire esperimenti utilizzando la tecnica convenzionale del patch clamp in configurazione whole cell per registrare il potenziale di membrana o la corrente di membrana dai neuroni identificati.L'identità del neurone può essere verificata a partire dalle proprietà elettrofisiologiche del neurone registrato e includendo etichette fluorescenti all'interno della soluzione intracellulare. Dopo l'esperimento per determinare la posizione del neurone registrato lungo l'asse dorso-ventrale, passare a un obiettivo a basso ingrandimento. Contrassegnare la posizione di interesse includendo l'elettrodo di registrazione in un'immagine oppure riducendo il diaframma del campo visivo.Per lasciare un cerchio luminoso intorno alla posizione di interesse in un'immagine duplicata, la regione mediale e quella dell'emisfero destro della corteccia e le aree circostanti della sezione per individuare con precisione la posizione della registrazione all'interno dell'immagine, il duplicato può quindi essere sovrapposto all'immagine iniziale della posizione di registrazione e dei suoi dintorni. Potrebbero essere necessarie fino a tre immagini distinte a basso ingrandimento per coprire l'area che va da una posizione di registrazione ventrale al margine dorsale della corteccia entorinale mediale. Queste immagini possono quindi essere unite tra loro utilizzando un software di elaborazione delle immagini.Il confine dorsale della corteccia entorinale mediale fornisce un utile punto di riferimento per misurare la posizione dorso-ventrale, ma il confine ventrale della corteccia entorinale mediale non è altrettanto ben definito. Qui, le sezioni parasagittali in contrasto interferenziale differenziale (DIC) e NIAL mostrano rispettivamente l'ippocampo di forma circolare e l'assenza di una protrusione parasferica a forma di anello nello strato uno della corteccia entorinale laterale. Queste sono immagini di sezioni tipiche che contengono la corteccia entorinale mediale.L'area paras è chiaramente evidenziata dalla colorazione con missile. Nelle immagini corrispondenti, il margine dorsale della corteccia entorinale mediale indicato dalla freccia nera si trova in posizione ventrale rispetto al gruppo di cellule orbicolari paras che sporge ampiamente nel primo strato, come indicato dalla freccia rossa. Di seguito è riportato un esempio di un'immagine composita a quattro ingrandimenti di una sezione para-sagittale.Le posizioni di una cellula dorsale e di una cellula ventrale sono indicate rispettivamente da cerchi pieni blu e verdi. La freccia nera indica il confine dorsale stimato della corteccia mediale interale ed è prolungata negli strati profondi dalla linea tratteggiata bianca. La linea bianca continua è una guida che mostra il percorso della contorno, lungo il quale viene effettuata la misurazione in pixel della distanza dal confine dorsale della corteccia mediale interale fino alle registrazioni delle cellule localizzate in posizione ventrale; qui sono mostrate le registrazioni delle cellule stellate dorsali e ventrali indicate.Queste registrazioni aiutano a stabilire l'identità delle cellule e illustrano come le proprietà elettriche della corteccia entorinale mediale variano. Le cellule stellate del secondo strato differiscono tra posizioni dorsali e ventrali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere estremamente accurati durante la preparazione delle sezioni, poiché sezioni di alta qualità sono essenziali per registrazioni elettrofisiologiche produttive.

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Il video dimostra la preparazione di fette di cervello collicolo-talamocorticale da cervelli di cuccioli di topo. Un cervello isolato viene allineato su un vetrino marcato e tagliato ad angolo per allineare il mesencefalo uditivo e il proencefalo sullo stesso piano. Il cervello viene quindi tagliato utilizzando un vibratomo e le fette contenenti le principali strutture uditive del mesencefalo e del proencefalo vengono trasferite in una camera di contenimento per la conservazione.

Preparazione di fette collicolo-talamocorticali da un cervello di cucciolo di topo

Questo video mostra un protocollo dettagliato per la preparazione di fette orizzontali di cervello ippocampale dai topi, concentrandosi sulla conservazione dell'integrità dei percorsi delle fibre ippocampali. Il processo prevede l'attenta bisezione e fissaggio del cervello, l'utilizzo di un vibratomo per affettare e il mantenimento delle condizioni tissutali ottimali con un fluido carbogenato, ottenendo fette di cervello ippocampale pronte per ulteriori sperimentazioni.

Ottenere fette orizzontali di cervello ippocampale di topo

Il video dimostra la preparazione di fette di corteccia cingolata mediale al talamo anteriore (MT-ACC) da cervelli di topo. Il cervello di un topo viene sezionato, vengono praticati tagli per esporre il percorso MT-ACC e vengono generate fette utilizzando un vibratomo. Le fette di MT-ACC vengono quindi mantenute nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato.

Generazione di fette di corteccia cingolata mediale al talamo anteriore da cervelli di topo

Il video descrive la registrazione elettrofisiologica delle sinapsi retinogenicolate e corticogenicolate in fette di cervello di topo. Le fette contenenti il nucleo genicolato laterale dorsale (dLGN) vengono poste in una camera di registrazione. Una pipetta stimolante è posizionata sul tratto ottico per stimolare le cellule gangliari retiniche (RGC) e studiare le sinapsi retinogenicolate o il nucleo reticolare talamo per stimolare i neuroni corticali e studiare le sinapsi corticogenicolate.

Uno studio elettrofisiologico delle sinapsi retinogenicolate e corticogenicolate in fette di cervello di topo

Questo video dimostra l'induzione di eventi ictali in fette corticali coronali da un topo transgenico che esprime canali cationici attivati dalla luce nei neuroni piramidali eccitatori corticali. La fetta viene posta in una camera di registrazione e un elettrodo di registrazione viene inserito nello strato corticale superficiale. Dopo la perfusione con un farmaco che induce convulsioni che blocca i canali del potassio, i neuroni diventano ipereccitabili e generano eventi ictali spontanei. Per...

Generazione di eventi ictali spontanei e on-demand in fette corticali cerebrali di topo

Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging.

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Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per ottenere sezioni appiattite tangenziale da cortecce dei mammiferi e visualizzare moduli corticali usando istochimiche e immunohistochemical metodi.

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Qui presentiamo protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo genetico laterale e l'indagine elettrofisiologica della funzione sinapsi retinogenica e corticogena. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per studiare le sinapsi con la probabilità ad alto rilascio e basso rilascio nelle stesse fette cerebrali acute.

Indagini elettrofisiologiche sulla funzione di sinapla Retinogeniculate e Corticogeniculate

Questo articolo ha lo scopo di descrivere un protocollo sistematico per ottenere fette orizzontali del cervello ippocampale nei topi. L'obiettivo di questa metodologia è preservare l'integrità delle vie della fibra ippocampale, come il percorso perforante e il tratto di fibra muschiata per valutare i processi neurologici correlati al giro dentato.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

Presentiamo un protocollo per preparare fette acute dall'ippocampo dorsale-intermedio dei topi. Confrontiamo questa preparazione trasversale con l'affezione coronale in termini di qualità delle registrazioni e conservazione delle caratteristiche morfologiche dei neuroni registrati.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Impara a preparare sezioni parasagittali della corteccia entorinale mediale per studiare l'organizzazione dorso-ventrale dei neuroni stellati. Questo metodo elettrofisiologico consente di analizzare le proprietà intrinseche delle cellule e le loro variazioni topografiche lungo l'asse dorsale-ventrale.

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Preparazione di sezioni parasagittali delle inchieste sui dorso-ventrale organizzazione della corteccia entorinale Rodent mediale

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