Uso di un modello animale di sepsi per valutare nuove terapie a base di erbe

Sepsi si riferisce ad una sindrome da risposta infiammatoria sistemica risultante da una infezione microbica, e può essere simulato da una tecnica chirurgica denominata legatura cecale e puntura (CLP). Qui si descrive un metodo per utilizzare CLP-indotta modello animale per lo screening erbe medicinali per gli agenti terapeutici.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre un modello murino di sepsi mediante una procedura chirurgica chiamata SQL Ligation and Puncture, o CLP. Ciò si ottiene praticando prima un'incisione della linea mediana da 1,5 a due centimetri sull'addome di un topo. Successivamente, il secum viene esposto e legato, quindi il seum viene perforato per indurre la traslocazione batterica.

Infine, l'incisione viene chiusa. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un aumento dei livelli sistemici e peritoneali di citochine, nonché sintomi come letargia e letalità. Quello che sto per mostrarvi è quello di produrre un modello di sepsi murina chiamato sation and puncture, che è stato modificato dal modello originale sviluppato dal Dr. Chandry e dai suoi collaboratori.

Il vantaggio principale di questo modello è che è il modello più rilevante di sepsi. Inoltre, è semplice, ben caratterizzato ed economicamente fattibile, e quindi è stato ampiamente utilizzato nel campo della ricerca sulla sepsi e l'infiammazione. A titolo di esempio, dimostreremo l'utilizzo di questo modello per valutare il potenziale terapeutico dell'estratto di erbe nella sepsi.

Per preparare l'estratto di erbe, immergere 10 grammi di erbe in 200 millilitri di acqua a 85 gradi Celsius per una o quattro ore per rimuovere le particelle insolubili, centrifugare la frazione acquosa a 3.300 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,2 micron. Quindi concentrare ulteriormente il filtrato utilizzando un filtro centrifugo con un taglio del peso molecolare di 10.000 kilodalton e centrifugando a 5.000 G per 60 minuti a quattro gradi Celsius.

Utilizzando colture di macrofagi sono state selezionate frazioni a basso e alto peso molecolare per l'inibizione delle attività di mediatori pro-infiammatori tardivi, come la scatola di gruppo ad alta mobilità o quella HGB. Per iniziare l'isolamento dei macrofagi, l'interperitoneale ha somministrato due millilitri di un brodo di glicole al 4% in topi normali dopo tre giorni di raccolta della coltura primaria dei macrofagi peritoneali, i macrofagi in DMEM integrati con il 10% di FBS, due millimolari di glutammina e l'1% di penicillina. La streptomicina lava delicatamente i macrofagi aderenti con optimum e li incuba nello stesso terreno per due ore.

Quindi stimolali con l'endotossina batterica lipopolisaccaride o LPS 16 ore dopo la stimolazione. Raccogliere il terreno condizionato con cellule e utilizzarlo per eseguire il western blotting. Per misurare i livelli di HM GB uno.

Quantificare l'intensità della banda utilizzando una curva standard generata con H mgb purificato per stabilire la sepsi dopo aver anestetizzato un topo con un'iniezione intramuscolare di 75 milligrammi per chilogrammo di ketamina e 20 milligrammi per chilogrammo di xilazina. E usando un pizzico per controllare il suo livello di sedazione. Posizionare il topo in posizione supina, pulire l'addome, quindi praticare un'incisione della linea mediana di 15 millimetri per esporre il cieco a circa cinque millimetri dalla punta del sequel con una sutura di seta da quattro oh.

Legare il cieco, quindi utilizzando un ago calibro 22 pungere una volta il moncone posteriore legato per consentire l'estrusione delle feci, riportare immediatamente il cieco nella sua normale posizione intraaddominale e chiudere l'addome. Dopo che gli animali riacquistano coscienza e mobilità. Riporta la gabbia nella stanza degli animali dopo 24 ore.

Dopo il CLP, somministrare intraperitoneale 200 microlitri di estratto di erbe o di controllo al giorno per tre giorni. Monitorare la sopravvivenza dell'animale per tutto il tempo necessario entro poche ore dalla legatura e puntura sequenziale o dall'intervento chirurgico CLP. Gli animali mostrano segni clinici di sepsi che includono piloerezione, letargia, rannicchiamento e diminuzione dell'assunzione di cibo e acqua.

Gli animali che sviluppano una grave peritonite con infezione sistemica consecutiva normalmente muoiono entro 48-96 ore. Tuttavia, anche gli animali abbinati per età, sesso e background genetico possono rispondere all'intervento chirurgico in modo distinguibile nel corso della sepsi sperimentale, ad esempio a 48 ore dopo la CLP. Mentre alcuni animali possono essersi avvicinati allo stato di tumulo come qui definito, altri possono rimanere in uno stato non moribondo.

Indagini complete sulle citochine circolanti hanno rivelato differenze drammatiche nei livelli di diverse citochine, tra cui IL sei, kc, MIP due e ST nfr, uno tra topi negli stati moribondi e non moribondi. In particolare, questi mediatori infiammatori sono stati classificati come marcatori surrogati della sepsi perché i loro livelli circolanti sono predittori affidabili di esito letale nella sepsi sperimentale o clinica. Inoltre, la CLP ha indotto il rilascio locale di varie citochine e chemochine pro e antinfiammatorie, ad esempio, a 48 ore dopo la CLP, quantità significative della citochina IL 6 e delle chemochine KC e MI P due possono ancora essere misurate non solo a livello sistemico nel sangue, ma anche localmente nel liquido di lavaggio peritoneale.

Qui, le capacità di vari estratti di erbe o composti di controllo sono state valutate per la loro capacità di inibire il rilascio di HGB indotto da endotossine. Quelli che avevano la capacità di inibire l'HGB in una sola versione sono stati ulteriormente testati in vivo utilizzando un modello murino di sepsi. A causa della cinetica tardiva e prolungata dell'accumulo di HGB uno nella sepsi sperimentale, la prima dose di inibitori di HGB uno è stata somministrata 24 ore dopo l'insorgenza della sepsi, un punto temporale in cui i topi hanno sviluppato chiari segni di sepsi, tra cui letargia, diarrea e piloerezione, come mostrato qui, somministrazione ritardata e ripetuta di un importante componente T verde epi Gallo, catechina tre gallato o EGCG a partire da 24 ore dopo l'insorgenza della sepsi, ha salvato in modo significativo i topi dalla sepsi letale anche quando somministrato per via orale L'EGCG ha comunque salvato i topi dalla sepsi letale, aumentando significativamente i tassi di sopravvivenza degli animali dal 16% al 44% Una volta padroneggiata questa legatura e il modello di puntura può essere terminato in meno di cinque minuti se viene eseguito correttamente.