Non invasiva Imaging di candidosi disseminata nelle larve Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare le tecniche per infettare le larve di zebrafish utilizzando il patogeno fungino candida albicans. In primo luogo, viene preparata una coltura fungina fluorescente e gli embrioni di pesce vengono rivestiti. Successivamente, i pesci vengono allineati su una capsula per iniezione di aros.

La Candida albicans viene microiniettata attraverso l'orecchio di ciascun pesce nel cervello posteriore nel ventricolo fisher, quindi incorporata in aeros a basso punto di fusione e visualizzata mediante microscopia a epifluorescenza. In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per visualizzare in modo non invasivo l'interazione ospite-patogeno nell'ambiente complesso dell'ospite piuttosto che il sistema semplificato della capsula di Petri. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'iniezione di vena è che si crea un'infezione localizzata che provoca una malattia disseminata letale.

Inoltre, questa tecnica consente un'iniezione efficiente delle cellule di C bucan, intrinsecamente grandi, in piccole larve di pesce zebra. Inizia strisciando un brodo di candida albicano su un pennarello di lievito. Piastra di agar destrosio, incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius per consentire alle colonie di crescere.

Una volta che le colonie sono visibili, utilizzare un tassello di legno sterile per raccogliere una colonia isolata e sciogliere il lievito in cinque millilitri di lievito fresco Estratto di brodo di destrosio pepto in provette di coltura da 16 x 150 millimetri. Posizionare la coltura su un tamburo a rulli per colture tissutali, dotato di una ruota per provette e di incubatori durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire un millilitro di coltura in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugarla a 14.000 volte, G per un minuto per pellettare le cellule, quindi scartare il supinato e agitare il pellet per allentarlo.

Risospendere le cellule in un millilitro di vortice di PBS e centrifugarle nuovamente. Quindi scartare il supinato e ripetere questo lavaggio. Passare tre volte per rimuovere eventuali residui di terreno di coltura.

Una volta che le cellule sono state lavate, contarle in un emocitometro a una diluizione da uno a 100 in PBS. Per una coltura di 12 ore, dovresti aspettarti da tre a quattro volte da 10 a otto cellule per millilitro. Reese's piega il lievito a una concentrazione finale di 10 per sette cellule per millilitro.

Usa un setaccio per raccogliere gli embrioni di pesce zebra da una vasca di deposizione delle uova il giorno prima dell'iniezione e conservali in una soluzione di acqua d'uovo contenente 60 milligrammi per millilitro di sali oceanici istantanei in acqua deionizzata sterile. Quindi posizionare gli embrioni a 33 gradi SIU per 24 ore con un ciclo di luce-buio di 12 ore. Ciò consente lo sviluppo dell'embrione fino allo stadio larvale primordiale di 25 anni, lo stadio ottimale per l'infezione il giorno dell'infezione.

Trasferisci gli embrioni con una pipetta di trasferimento in 60 millilitri di acqua d'uovo in una capsula di Petri extra profonda. Quindi l'utente disseziona il microscopio e le pinzette dumont per rivestire gli embrioni. Questo può essere ottenuto separando delicatamente il Corian come un sacchetto di patatine fino a quando il pesce non fuoriesce.

Una volta che tutti gli embrioni sono stati decoperti. Quindi mentre la capsula di Petri sposta il pesce verso il centro, trasferisci il pesce sul coperchio della pirofila, rimuovi il mezzo e sostituiscilo con acqua fresca d'uovo. Aggiungere il pesce all'acqua fresca dell'uovo.

Preparare una soluzione da 200 microgrammi per millilitro di trica metano solfonato per anestetizzare il pesce utilizzando una pipetta di trasferimento. Raccogli da 20 a 50 embrioni e sostituiscili nella soluzione anestetica per uno o due minuti o fino a quando non smettono di muoversi. Nel frattempo, accendere l'unità di iniezione, assicurandosi che la pressione sia impostata sull'impulso e che la durata dell'impulso sia impostata su nove con tre PSI per l'unità di contropressione.

Aprire gradualmente la valvola sul serbatoio dell'azoto fino a quando la pressione di iniezione raggiunge i 30 PSI. Quindi caricare la micropipetta in pool con cinque microlitri di soluzione vortex candida albican e posizionarla nel supporto per micro pipette. Posizionare una capsula di Petri extra profonda contenente acqua sul tavolino del microscopio da dissezione e regolare la posizione delle micropipette fino a quando non è in vista e la sua punta è solo parzialmente immersa nell'acqua.

Quindi, usando una pinzetta, agganciare l'ago della pipetta a circa tre millimetri dalla punta. Se l'ago è stato agganciato correttamente, premendo l'interruttore a pedale dell'unità di iniezione dovrebbe essere possibile l'erogazione del liquido. Utilizzando un vetrino graduato, misurare il volume erogato, quindi regolare la pressione in modo che il volume di liquido erogato sia di 0,21 millimetri di diametro o appena inferiore alle dimensioni della pupilla di un embrione di pesce zebra.

Una volta che il microscopio è stato installato e i pesci sono stati anestetizzati, gonfiare il piatto per attirare i pesci al centro e prenderli in una pipetta di trasferimento. Picchiettare con cautela il lato della pipetta in modo che il pesce si depositi sulla punta. Quindi, utilizzando il minor volume possibile, depositare delicatamente il pesce su una piastra per iniezione di alci larvale preriscaldato a 28 gradi Celsius.

Usando una canna di vetro liscia, allinea con cura il pesce. Quindi, con un tovagliolo di carta, rimuovere quanto più liquido possibile dal piatto. Posizionare il piatto aros con il pesce al microscopio fino a quando sia l'ago che il primo pesce sono ben visibili.

Assicurati che ogni pesce sia ancora vivo osservando la presenza di un battito cardiaco visibile. Se è morto, scartalo e passa a quello successivo. Sposta l'ago di vetro verso il pesce zoomando verso l'interno.

Mentre lo fai, inserisci con cura l'ago nella struttura circolare dell'orecchio del pesce con due pietre per le orecchie situate appena dietro l'occhio. Una volta che l'ago è in posizione, iniettare il lievito utilizzando l'interruttore a pedale. Se l'ago è inserito correttamente, il ventricolo cerebrale posteriore del pesce oscillerà leggermente dopo l'iniezione, ritrarrà l'ago e ripeterà la procedura con il pesce successivo.

L'intero processo non dovrebbe durare più di 15 o 20 minuti, altrimenti il pesce si asciugherà e morirà dopo questo tempo. Il lievito si depositerà anche sul fondo della micropipetta e porterà a un'infezione irregolare, dosi e/o intasamento della micropipetta raggruppata. Una volta che tutti i pesci sono stati iniettati, usa l'acqua d'uovo per lavarli via dagli aros e metterli in una capsula di Petri fresca contenente 60 millilitri di acqua d'uovo.

Quindi posizionare il piatto a 28 gradi Celsius. Chiudere la valvola dell'azoto, impostare l'interruttore di iniezione su continuo per scaricare la pressione nella linea del serbatoio. Quindi, quando la pressione scende a zero, riportare l'interruttore su pulsato e spegnere l'unità di iniezione.

Inizia anestetizzando il pesce infetto in trica metano solfato come descritto in precedenza. Una volta che i pesci sono stati anestetizzati, utilizzare una pipetta per trasferire un pesce alla volta in una capsula di Petri contenente lo 0,4% di agar a basso punto di fusione. Quindi utilizzando una pipetta di trasferimento e portando con sé il minor numero possibile di agro.

Trasferire ogni pesce dalla capsula di Petri in un pozzetto di una piastra di imaging con fondo di vetro a circa 0,2 millilitri e 0,4% di fusione bassa integrata con 200 microgrammi per millilitro di anestetico sulla parte superiore del pesce in modo che i cerchi interni siano riempiti e un sottile strato di aros si diffonda sul fondo del pozzetto. I pesci possono ora essere ripresi per un massimo di 24 ore utilizzando un microscopio invertito con un sistema confocale a scansione laser. Cinque ore dopo aver infettato il pesce zebra con candida albicans rossa fluorescente.

Il lievito è visibile nel cervello posteriore del pesce nei pesci FL I e EGFP, come questi, l'endotelio vascolare e le cellule simili ai macrofagi in tutto il corpo del pesce sono fluorescenti. Sono mostrati qui in verde, cinque ore dopo l'infezione. Il lievito può essere visto all'interno di cellule simili a macrofagi entro 24 ore.

L'infezione si è disseminata lungo il tessuto dorsale della coda, dove il lievito può essere nuovamente rilevato all'interno delle cellule FTIC. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come microiniettare la candida albicans nel ventricolo del rombencefalo del pesce zebra allo stadio Prim 25, incluso uno che prepara la coltura fungina, due larve di pesce zebra anestetizzante. Tre micro iniezioni nel ventricolo rombencefalico.

E quattro, preparare le larve infette per l'imaging confocale.