Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dell'ambiente root usando il RootChip

Questo articolo fornisce un protocollo per la coltivazione di piantine di Arabidopsis in RootChip, una piattaforma di imaging microfluidico che combina controllo automatizzato delle condizioni di crescita con il monitoraggio radice al microscopio e FRET-based misura i livelli di metaboliti intracellulari.

Al fine di fornire la massima resa, le piante devono essere fornite con una serie di nutrienti, carenze nutrizionali, stress come il freddo o il caldo estremo, siccità o agenti patogeni causano enormi perdite di resa del raccolto ogni anno. L'origine di molti di questi problemi risiede spesso in clandestinità. La radice è l'ancora fisica della pianta, ma è anche l'organo responsabile dell'assorbimento dell'acqua e dell'assorbimento di nutrienti minerali come azoto, solfato di fosforo e molti oligoelementi.

Se vogliamo sviluppare approcci sostenibili per produrre un'elevata resa delle colture, dobbiamo capire meglio come si sviluppano le radici, come assorbono questo ampio spettro di nutrienti e come interagiscono con gli organismi simbiotici e patogeni. Per fare questo, dobbiamo essere in grado di esplorare le radici a livello microscopico Per ovvie ragioni. Studiare la biologia delle radici è sempre stato più impegnativo dello studio delle parti aeree della pianta.

Poiché le radici sono solitamente nascoste sottoterra, non sono facilmente accessibili per studi microscopici. La rimozione dal terreno provoca gravi danni all'apparato radicale e quindi non è un buon modo per studiarne il comportamento. Una soluzione per rendere le radici più accessibili è farle crescere su jeed o è mostrato in questo esempio in mezzi idroponici.

I piani di coltivazione in terreni gelatinosi o in mezzi idroponici sono stati utilizzati con successo in molti studi sulle radici, ma con questi metodi è ancora molto difficile studiare le radici in dettaglio microscopico e per lunghi periodi di tempo per avvicinarsi il più possibile alla radice in crescita ed evitare qualsiasi stress fisico dovuto alla preparazione per l'imaging, Costruiamo una piattaforma che ci permette di far crescere e visualizzare le radici, e allo stesso tempo ci permette di controllare e modificare il microambiente delle radici con altissima precisione e velocità. Questa piattaforma l'abbiamo chiamata root chip. Il chip di radice è un dispositivo microfluidico fabbricato da PDMS, un polimero organico a base di silicone.

Il chip è dotato di camere di osservazione per la crescita e l'imaging delle radici di piantine di opsi di coniglio. I semi germinano prima in coni di plastica fabbricati con puntali di pipette di plastica, che riempiamo con terreni solidi. La punta della radice cresce quindi attraverso il terreno e raggiunge la camera dove sperimenta un flusso continuo di mezzo liquido, mantenendo le condizioni nella camera.

Le valvole micromeccaniche costanti sviluppate dal laboratorio di Steve Quake presso la Stanford University sono mostrate in rosso. Poiché il chip è montato su un vetro di copertura trasparente, come tipicamente utilizzato per la microscopia, tutti i processi nella camera di osservazione possono essere monitorati su un microscopio invertito. La struttura a canale biforcato che guida il flusso del fluido può essere vista al microscopio.

Il chip radicolare è costituito da due strati, uno strato di controllo contenente le valvole in uno strato di flusso contenente i canali attraverso i quali le soluzioni di test dei terreni di crescita fluiscono verso le camere di osservazione. Il volume di queste camere è di circa 400 nanolitri. Ciò significa che sono necessarie solo quantità molto piccole di soluzione e che le condizioni possono essere modificate molto rapidamente.

Questo protocollo descrive come le radici vive di otto piantine o di Arabidopsis vengono preparate per l'imaging microscopico parallelo sul chip radicolare e osservate per un massimo di tre giorni, iniziando riempiendo una piastra di Petri da 10 millimetri con terreno di crescita contenente l'1% di agar mentre il terreno è ancora liquido. Riempire i puntali delle pipette da 10 microlitri con cinque microlitri di terreno dalla capsula di Petri utilizzando una pipetta multicanale. I puntali riempiti vengono conservati nella scatola dei puntali della pipetta fino a quando il terreno non è solido.

Quindi tagliare in coni di plastica lunghi quattro millimetri e metterli in posizione verticale in una capsula di Petri contenente un terreno di coltura solido. Dopo la sterilizzazione superficiale, i singoli semi vengono posti sopra i coni riempiti di terreno. Il piatto viene quindi sigillato con nastro adesivo microporoso e la piastra viene conservata a quattro gradi per sincronizzare la germinazione.

Dopo tre giorni, le piastre vengono trasferite in una cella di crescita per iniziare la germinazione. Le nostre condizioni di crescita in questo esperimento sono di 23 gradi. A un momento clou di 16 ore, un ciclo di oscurità di otto ore tra cinque e sette giorni dopo la germinazione, la piantina dovrebbe essere pronta per il trasferimento alla lunghezza della radice della salute della piantina e, se applicabile, l'espressione di un marcatore fluorescente dovrebbe essere controllata al microscopio da dissezione.

Non appena le punte delle radici delle piantine raggiungono l'uscita inferiore del cono di plastica, le singole piantine vengono contrassegnate per il trasferimento sul chip. 10 piantine di piante dovrebbero essere selezionate nel caso in cui una venga danneggiata durante il trasferimento per sterilizzare il chip della radice. Per esperimenti a lungo termine, il dispositivo viene avvolto in un fazzoletto, posto in una capsula di Petri di vetro e in un'autoclave.

Questo chip è stato appena autoclave prima. L'esperimento dopo il raffreddamento del chip viene ricoperto con mezzi di crescita liquidi. Il chip deve essere completamente coperto, ma il livello del fluido non deve essere superiore a tre millimetri sopra la superficie del chip.

Una pipetta da 20 microlitri viene utilizzata per estrarre il terreno attraverso l'ingresso della radice e l'uscita della camera. Questo riempie la camera di osservazione. Con i media selezionati, i coni di plastica vengono ora inseriti nel chip radice.

Il cono dovrebbe adattarsi perfettamente alle prese d'aria. Poiché il chip di radice è montato su un sottile strato di vetro ottico, bisogna fare attenzione a non applicare troppa pressione al chip. Durante questa fase, il chip viene ora preparato per un'incubazione notturna all'interno del mezzo liquido per evitare che il chip galleggi.

Due vetrini, uno tagliato a metà, vengono posizionati sul chip. Viene aggiunta un'ancoretta magnetica e il piatto viene chiuso. L'assemblaggio viene ora trasferito in un'agitazione magnetica, che agiterà delicatamente il terreno per facilitare la crescita delle radici verso gli sbocchi.

Il chip di radice. Gli ingressi sono punzonati ad angolo per supportare ulteriormente la crescita nella direzione desiderata. Inclinare leggermente il gruppo sollevando il lato del chip che si trova di fronte alle uscite.

Il chip è illuminato con una lampada ad anello Collegato a un timer per mantenere il ritmo chiaro e scuro. Dopo l'incubazione notturna, il terreno di coltura liquido viene preparato in una fiala pressurizzata sigillabile. I seguenti passaggi devono essere eseguiti rapidamente e senza interruzioni per evitare l'essiccazione delle piantine.

Il chip viene ora rimosso dal mezzo liquido e posizionato capovolto nell'apertura inferiore del portachip, anch'essa invertita. Il truciolo deve essere orientato in modo che il lato contenente gli ingressi dello strato di controllo sia rivolto verso il lato della linea di pressione. Due grandi connettori nella parete laterale del portapacchi.

Il vetro di copertura sul fondo del chip viene asciugato tamponando delicatamente con carta velina e fissato al supporto. Con il nastro adesivo, l'intero assemblaggio viene quindi invertito. I connettori dei tubi vengono riempiti d'acqua con una siringa e ogni connettore del tubo viene inserito nell'ingresso corrispondente.

Sul chip. Il tubo è collegato al supporto e alla soluzione. Le fiale e l'aria vengono quindi rimosse dalle linee applicando pressione alla soluzione bile con una siringa d'aria, il supporto viene ricoperto di plastica trasparente.

Per mantenere un'elevata umidità nell'assemblaggio, il supporto viene posizionato sul tavolino del microscopio. Dovrebbe adattarsi esattamente alle tacche del palco. Le valvole del chip, così come il flusso del fluido attraverso il chip, sono controllate dalla pressione dell'aria.

Due linee con regolatori sono diramate da una linea di pressione principale. Uno viene utilizzato per controllare il flusso del fluido e l'altro è collegato alle elettrovalvole dell'aria. Queste valvole sono azionate dal computer tramite il controller della valvola USB e sono responsabili dell'azionamento delle valvole sul chip.

Entrambi i regolatori di pressione devono essere chiusi prima di collegare il chip. I tubi, i connettori e le fiale di soluzione sono ora collegati alle linee di pressione corrispondenti. Alcuni millilitri d'acqua vengono aggiunti ai serbatoi del vettore.

Potrebbe essere necessario ripetere questo passaggio nel corso di esperimenti più lunghi. Per mantenere alta l'umidità, mantenere il carico volumetrico per ridurre al minimo la potenziale quantità di liquido che potrebbe essere versata sul microscopio. La luce anulare viene spostata in posizione sopra il chip per mantenere il ciclo di luce-buio fino all'inizio dell'esperimento.

Le valvole sul chip vengono chiuse applicando pressione, in questo caso aprendo le elettrovalvole dell'aria. L'interfaccia di visualizzazione del laboratorio consente il controllo delle valvole facendo clic sul pulsante sotto il numero della valvola. Il verde brillante indica l'applicazione della pressione e la chiusura di una valvola del truciolo.

Questo schema illustra l'organizzazione del sistema di valvole, mentre le valvole da quattro a otto agiscono come valvole singole, da zero a tre atti. In gruppi con questo sistema, una singola camera può essere indirizzata attivando una combinazione di valvole, ad esempio, per guidare il flusso del fluido esclusivamente verso la terza camera dalle valvole superiori che devono essere chiuse le valvole zero, tre e quattro. Inoltre, le valvole sei, sette e otto controllano quale soluzione viene utilizzata per il lavaggio degli ingressi A, B e C ora attivano tutte e tre le valvole di ingresso della soluzione per chiuderle.

L'interfaccia del controller è dotata di un circuito di feedback, che consente il monitoraggio dello stato del sistema. Questa funzione può essere attivata facendo clic sul pulsante di rilettura. Il regolatore di pressione per lo strato di controllo è aperto per primo e impostato su 15 PSI.

Quindi il regolatore per lo strato di flusso è aperto e impostato a cinque PSI. La valvola di ingresso per il terreno di coltura scelto viene aperta e le camere vengono lavate con i percorsi del flusso del fluido devono essere controllati al microscopio. Nella maggior parte dei casi, l'aria è intrappolata nei canali e deve essere rimossa.

Inoltre, i canali dell'aria di controllo contengono ancora aria che deve essere espulsa e sostituita dall'acqua proveniente dai connettori dei tubi. Questo processo è chiamato riempimento del vicolo cieco. Entrambi i compiti vengono raggiunti lavando più volte ciascuna delle otto camere fino a quando tutta l'aria non viene forzata dai canali nel PDMS.

Il sistema può essere programmato per automatizzare gli esperimenti. Tali routine possono anche essere utilizzate per degassare il chip. Lo scopo principale del chip radice è quello di combinare una piattaforma di imaging e un sistema di profusione in un unico dispositivo.

Per dimostrare la manipolazione del microambiente delle radici, abbiamo lavato le camere con colorante e misurato lo scambio di fluido all'interno delle camere. Alla pressione consigliata di cinque PSI, abbiamo misurato uno scambio completo entro 10 secondi a una portata calcolata di circa 1,5 microlitri al minuto. Abbiamo anche osservato la crescita delle radici delle piantine, in questo caso coltivate al buio e alimentate con 10 millimolari di glucosio come fonte di energia esterna.

A seconda delle condizioni di crescita, come la luce e la composizione del substrato, le piante possono essere osservate nel truciolo radicale per un massimo di tre giorni. Questo sistema è stato utilizzato per monitorare i livelli intracellulari di glucosio e galattosio nelle radici che esprimono nanosensori geneticamente codificati. Questi sensori basati sul trasferimento di energia di prima o di risonanza o sui tasti sono stati sviluppati nel laboratorio di Fromer.

Per questo esperimento, le radici del chip sono state perfuse con impulsi quadrati di glucosio o soluzione di galattosio. I livelli intracellulari di zuccheri sono stati monitorati e sono mostrati qui, espressi come rapporto tra l'intensità del fluoro quattro citrino accettore e l'intensità dell'ECFP del donatore a sinistra. Osserviamo la quantità di sensori citrino al centro o l'immagine metrica del rapporto della punta della radice e, a destra, tracciamo la quantità di zucchero in risposta a tre impulsi quadrati ripetuti di glucosio in verde e galattosio mostrato in rosso.

L'aumento del rapporto indica un accumulo di zucchero. I principali vantaggi del chip radicolare rispetto ai metodi di crescita convenzionali sono la preparazione minimamente invasiva per la microscopia, la capacità di alterare in modo reversibile e ripetuto l'ambiente radicale e la capacità di osservazione continua di tessuti evolutivamente competenti e fisiologicamente sani per un periodo di giorni. Un altro vantaggio davvero importante è che sono necessarie solo quantità minime di liquido per fornire alle radici tutti i nutrienti necessari nel tempo.

Questo rende il cippone radicolare molto conveniente, soprattutto quando vengono applicati reagenti costosi. Continuiamo a ottimizzare il chip radicale e ad estenderne l'usabilità perché crediamo che rendendo questo importante organo più accessibile per i trattamenti e l'osservazione, strumenti microfluidici come il chip radicolare apriranno potenzialmente nuove dimensioni alla ricerca sulle piante. Maggiori informazioni su come costruire un sistema di chip di root sono disponibili sul nostro sito web.

I chip possono essere ordinati presso la Stanford Foundry.