Name: Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dellambiente root usando il RootChip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Scopri la coltivazione di Arabidopsis con RootChip per studiare lo sviluppo radicale in condizioni controllate. Questo metodo microfluidico consente l'imaging a lungo termine e la manipolazione precisa dell'ambiente radicale.

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Ringraziamo Philipp Denninger aiuto con video di preparazione e Bhavna Chaudhuri per la fornitura di linee di piante che esprimono FRET sensori. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della National Science Foundation (MCB 1.021.677), il Dipartimento dell&#39;Energia (DE-FG02-04ER15542) al WBF, il National Institutes of Health, e la Howard Hughes Medical Institute a SRQGG è stato sostenuto da un lungo EMBO termine borsa di studio. MM è stato sostenuto dalla Alexander von Humboldt Foundation.

Nota: eseguire tutte le fasi fasi preparatorie in condizioni sterili. 1. Preparazione del Coni in plastica per germinazione dei semi <ol><li> Riempire a 10 centimetri capsula Petri con terreno di coltura contenente 1% di agar a uno spessore di 5 mm. Usiamo un punto di forza un mezzo modificato Hoagland media 4, ma la composizione media dovrebbe essere scelto in base alle singole esigenze sperimentali. </li><li> Mentre il mezzo è ancora liquido, utilizzare una pipetta multicanale per riempire puntali 10 microlitri con 5 microlitri di terreno dalla piastra di Petri. </li><li> Conservare le punte piene nella casella di punta della pipetta fino a quando il terreno è solido, quindi tagliare a 4 coni di plastica mm di lunghezza e mettere in piedi in una capsula di Petri contenente terreno solido di crescita. </li></ol> 2. Germinazione dei semi e la crescita delle piantine <ol><li> Surface sterilizzare semi in 5% NaOCl per 5 min, lavare tre volte con acqua sterile, quindi inserire un singolo seme sopra l&#39;del mezzo-riempita conos. </li><li> Sigillare il piatto con del nastro Micropore (3M) e conservare a 4 ° C per sincronizzare la germinazione. </li><li> Dopo tre giorni, trasferire i piatti per un armadio di crescita per iniziare la germinazione. Le nostre condizioni di crescita sono 23 ° C ad una 16h ciclo di alta light/8h scuro (intensità luminosa: 100 μE m -2 s -1). </li><li> Tra il 5 e 7 giorni dopo la germinazione, le piantine devono essere pronti per il trasferimento al RootChip. A questo punto, punte delle radici dovrebbe essere vicino ai scarichi di fondo dei coni di plastica. Controllare la salute piantina, lunghezza radice e, se del caso, espressione di un marcatore fluorescente sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Segna singole piantine per il trasferimento sul chip. Selezionare una decina di piantine nel caso in cui uno è danneggiato durante il trasferimento. </li></ol> 3. Trasferimento di piantine sul RootChip <ol><li> Per sterilizzare il RootChip per esperimenti a lungo termine, avvolgereil dispositivo in carta velina, posto in un piatto di vetro Petri, e autoclave. </li><li> Una volta che il RootChip si è raffreddato, coprire con terreno di coltura liquido. Il RootChip dovrebbe essere completamente immerso, ma il livello del liquido dovrebbe essere non più di 3 mm dalla superficie RootChip. </li><li> Con una pipetta 20 microlitri, tirare mezzo attraverso l&#39;ingresso e uscita della camera principale per riempire la camera di osservazione con il terreno. </li><li> Coni di plastica Plug selezionato al punto 2.5 in RootChip le insenature. I coni devono adattarsi comodamente alle bocche di porto. Poiché il RootChip è montato su uno strato sottile di vetro ottico, non applicare una pressione eccessiva al chip. </li><li> Incubare la RootChip notte in mezzo liquido. Per evitare galleggiante, posizionare due lastre di vetro sul chip. Aggiungere una barra di agitazione magnetica e chiudere il piatto. </li><li> Trasferire l&#39;assemblea a un agitatore magnetico e agitare delicatamente il mezzo. </li><li> Il insenature RootChip si incrociano i canali in un angolo di 30 ° al dispositivo normale FACIlitate crescita delle radici nei canali (Figura 1A). Per supportare ulteriormente la crescita nella direzione desiderata, inclinare leggermente il gruppo inserendo un vetrino sotto la capsula di Petri sul lato opposto del circuito delle uscite. </li><li> Per mantenere il ciclo luce / buio, illuminare le piante con una lampada anello (intensità luminosa: 100 μE m -2 s -1) collegato a un timer. </li></ol> 4. Collegamento del RootChip al Vettore <ol><li> Il giorno seguente, riempire un sigillabile, fiala pressurizzabile con terreno di coltura liquido (Figura 1B). </li><li> Capovolgere il chip carrier e posizionarlo su una superficie stabile. Rimuovere il RootChip dal mezzo liquido e inserirla lato PDMS basso nell&#39;apertura inferiore del chip carrier. Orient il chip in modo che il lato che contiene le bocche di controllo di livello è di fronte al lato dei connettori pressione tubi linea nella parete laterale vettore. </li><li> Essiccare il vetro di copertura sulfondo del chip delicatamente blotting con carta velina. Fissare il RootChip al vettore con nastro ea destra tutta l&#39;assemblea. </li><li> Connettori tubi sono ottenuti tagliando tubo flessibile in plastica microbore (TYGON, 0.20 &quot;ID x 0.060&quot; OD) in pezzi lunghi 5 cm e il collegamento a tubi in acciaio inox microbore (New England piccolo tubo, 0.025 &quot;OD x 0,013&quot; ID x 0,75 &quot; lungo). Riempire i connettori tubi con acqua utilizzando una siringa e spina ciascun connettore tubo nell&#39;ingresso corrispondente livello di controllo sul chip. L&#39;acqua poi riempire i canali di controllo di livello e possono essere usate per trasmettere la pressione alle valvole micromeccanica. </li><li> Inserire le estremità opposte delle linee nei supporti / flacone soluzione (s). Applicare pressione sul flacone della soluzione con una siringa d&#39;aria. L&#39;incremento della pressione dell&#39;aria all&#39;interno della fiala soluzione forzerà liquida nelle linee. </li></ol> 5. Montaggio del RootChip al microscopio <ol><li> Posizionare il vettore sul microscfase di Ope. Per ridurre la possibilità del Gruppo di cambio nel corso dell&#39;esperimento a causa delle vibrazioni nella camera, il vettore deve adattarsi esattamente nelle tacche dell&#39;inserto stadio. </li><li> Le valvole di chip e il flusso del fluido attraverso il chip sono controllati dalla pressione dell&#39;aria. Due linee con regolatori sono ramificati fuori di una linea di pressione principale - uno viene utilizzato per controllare il flusso medio attraverso i canali, e l&#39;altro è collegato ad sfiati elettrovalvole che azionano le valvole push-up del livello di controllo. Le elettrovalvole sono azionate dal computer attraverso la valvola USB controller (sviluppato da Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Chiudere entrambi i regolatori di pressione prima di collegare il chip. </li><li> Aggiungere alcuni ml di acqua ai serbatoi del vettore per mantenere l&#39;alto tasso di umidità all&#39;interno del gruppo. Questa operazione deve essere ripetuta nel corso di lunghi esperimenti per mantenere le piante si secchino. Mantenere il volume basso per ridurre al minimo tegli quantità di liquido che potrebbe essere versato sul microscopio. Per esperimenti a lungo termine, il deflusso dai punti vendita di chip possono essere guidati nei serbatoi del vettore collegando i punti vendita di chip per i serbatoi con tubi microbore (vedi punto 4.4). In alternativa, il deflusso che si accumula sulla superficie del chip possono essere raccolti per pipettamento. </li><li> Preparare fogli a quadretti di plastica trasparente da protezioni in lamiera (C-Line). Fissare la plastica trasparente per il vettore da nastro biadesivo per mantenere l&#39;umidità elevata nel gruppo. </li><li> Posizionare la luce ad anello sopra il chip e mantenere il ciclo luce / buio. La luce &#39;anello deve essere spento prima dell&#39;inizio di ogni esperimento che utilizza marcatori fluorescenti, come l&#39;illuminazione diretta interferisce con collezione di immagini. </li></ol> 6. Funzionamento del RootChip utilizzando l&#39;interfaccia LabView L&#39;interfaccia di controllo RootChip per la piattaforma software LabVIEW è in gradoessere scaricato dal nostro sito <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> Le valvole sul chip sono chiusi applicando pressione al livello di controllo, in questo caso aprendo le elettrovalvole aria. L&#39;interfaccia di controllo consente l&#39;attivazione delle valvole facendo clic sul pulsante qui sotto il numero della valvola. Verde brillante indica applicazione di pressione e la chiusura di una valvola di chip (Figura 2B). Attivare tutte e tre le soluzioni, le valvole di aspirazione a l&#39;interfaccia di controllo prima di aprire i regolatori di pressione. Nota: L&#39;interfaccia di controllo dispone di un anello di retroazione, che consente il monitoraggio dello stato del sistema. Questa funzione può essere attivata facendo clic sul pulsante &quot;rilettura&quot; nell&#39;interfaccia controller. </li><li> Aprire il regolatore di pressione per il livello di controllo ed inizialmente è impostato a 15 psi, quindi aprire il regolatore per il livello di flusso e inizialmente impostata a 5 psi. DipendenzaDing sulla portata desiderata, le pressioni possono essere regolato in seguito. </li><li> Aprire la valvola di aspirazione per mezzo di crescita di scelta per lavare le camere con il terreno. </li><li> Controllare percorsi di flusso sotto il microscopio. Tipicamente, aria viene intrappolata nei canali di flusso e deve essere rimosso. Inoltre, i canali del livello di controllo contengono ancora aria che deve essere forzata e sostituito dal l&#39;acqua dai connettori di tubi (morto-end riempimento). Entrambi i compiti vengono raggiunti da lavaggio ciascuno degli otto volte più camere (5 psi) fino a quando tutta l&#39;aria viene forzata dai canali nel PDMS (&quot;degasaggio&quot;). Nota: L&#39;interfaccia di controllo può essere programmato per automatizzare esperimenti. Routine può anche essere utilizzato per degassare il chip. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Lo scopo principale del RootChip è di combinare una piattaforma di imaging e un sistema di perfusione in un unico dispositivo con un elevato livello di integrazione. Per dimostrare la manipolazioneil microambiente di radici arrossimmo le camere con colorante alimentare scuro (diluizione 1:4 in ambiente idroponico) e misurato lo scambio di fluido all&#39;interno delle camere. Alla pressione raccomandata di 5 psi abbiamo misurato uno scambio completo entro 10 secondi ad una portata calcolata di circa 1,5 microlitri / min (Figura 3). Abbiamo osservato inoltre la crescita delle radici di piante, in questo caso coltivati ​​al buio e fornito con 10 mM di glucosio come fonte di energia esterna (Figura 4). A seconda delle condizioni di crescita quali la luce e la composizione del mezzo, le piante possono essere osservato nel RootChip per un massimo di tre giorni. La RootChip è stato usato per monitorare i livelli di glucosio e galattosio intracellulare in radici esprimono nanosensori geneticamente codificati, basato sul trasferimento di Förster Resonance Energy (FRET) 5-7. Radici nel chip sono stati perfusi con impulsi quadrati o soluzione di glucosio galattosio ( <strong&gt; Figura 5). I livelli intracellulari di zuccheri sono stati monitorati e sono mostrati qui espresso come rapporto dell&#39;intensità della Citrine fluoroforo accettore all&#39;intensità del ECFP donatore. L&#39;aumento nel rapporto indica accumulo di zucchero. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. RootChip principio. <ol class="ualpha"><li> Il RootChip dispone di otto camere di osservazione per la crescita e l&#39;imaging di radici. I semi germinano prima in coni di plastica - fabbricato da puntali di plastica - che sono pieni di terreno solido. La punta radice cresce attraverso il mezzo e raggiunge la camera in cui un flusso continuo di liquido mantiene le condizioni nella camera costante. Valvole di micromeccanica (rosso) controllare il flusso. Il chip è montato su un vetro di copertura ottico. Disegno non in scala. (Adattato con il permesso di Grossmann et al., 2011 Plant Cell). </li><li> Scheme di una fiala di soluzione pressurizzabile con membrana (rosso). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Collegamento e montaggio del RootChip. <ol class="ualpha"><li> Vista dall&#39;alto del RootChip completamente connessa e il supporto montato su un microscopio invertito. </li><li> Schema illustrante il sistema di otturatore e l&#39;interfaccia di controllo. Un esempio di una valvola di taratura per guidare il flusso di fluido ad una singola camera è mostrato. Mentre valvole 4 a 8 funge da valvola singole, valvole da 0 a 3 atto a gruppi. Con questo sistema una camera singola possono essere affrontate attivando una combinazione di valvole. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Scambio di soluzioni nel ch osservazioneambre. visualizzazione dello scambio di fluido in una camera di osservazione usando soluzione colorante. L&#39;immagine è una sovrapposizione di campo chiaro e falsi colori intensità del segnale colorante. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. On-Chip crescita delle radici. Osservazione di una singola radice crescente esprimere una fluorescente FRET nanosensori di glucosio / galattosio nel corso di 20h. Formato ora: hh: mm, barra di scala: 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Misura i livelli di zucchero intracellulari mediante FRET nanosensori. <ol class="ualpha"><li> La quantità di sensore viene indicato come intensità citrino all&#39;interno della punta della radice (a sinistra). La risposta del intracellulare FRET nanosensori all&#39;applicazione di glucosio o galattosio soluzione è mostrata come immagini raziometrici. (Adattato con il permesso di Grossmann et al., 2011 Plant Cell) bar Scala:. 100 um. </li><li> Analisi FRET rapporto cambia in risposta a tre impulsi ripetuti quadrati di glucosio (verde) e galattosio (rosso). </li></ol>

<ol><li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors%3A+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li>
<li>Loqué, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wirén, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li>
<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li>
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<li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li>
<li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li>
<li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-in-chip%3A+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

I vantaggi principali del RootChip rispetto ai metodi convenzionali di crescita sono la preparazione minimamente invasivo per la microscopia, la capacità di alterare reversibilmente e ripetutamente l&#39;ambiente radice, e la capacità di osservazione continua di tessuto evolutivamente competente e fisiologicamente sano per un periodo di diversi giorni. In precedenza, piantine sono state cresciute verticalmente su supporti gelificati e trasferiti ad un sistema di perfusione immediatamente prima dell&#39;esperimento, che ha consentito solo misurando radici uno alla volta 8. Strumenti microfluidici sono stati utilizzati per Arabidopsis, ma su un livello di integrazione basso 9 o senza controllo perfusione 10. Il RootChip combina un elevato livello di integrazione con la possibilità di automatizzare gli esperimenti attraverso l&#39;orientamento del flusso preciso. Un altro vantaggio di questa piattaforma, caratteristica di tutti i dispositivi microfluidici 11, è che solo quantità minime di liquido sono tenuti a fornire alla radice con il dado necessariaRients, anche per gli esperimenti che coprono diversi giorni. Il RootChip è attualmente concepito come un dispositivo monouso, ma dal momento che i costi di produzione di chip sono bassi, le piccole quantità di reagenti consumati rende il chip ancora molto conveniente. Ci sono alcuni punti critici che devono essere adottate per garantire la salute delle piantine: Il volume dei coni di plastica è solo ul 3-4, che inizierà ad asciugare se esposto all&#39;aria. Quindi è importante che i coni vengono trasferiti sul chip rapidamente e l&#39;umidità è mantenuta alta fino a quando le radici hanno raggiunto le camere di osservazione, che li alimentano con acqua sufficiente. Passi 4.2 a 4.5 devono essere eseguite in modo rapido e senza interruzioni per evitare l&#39;essiccazione delle piantine. Passi 3.5 - 3.8 descrivono l&#39;incubazione del chip in mezzi liquidi durante il quale le radici crescono nelle camere di osservazione. Questo passaggio può essere saltato montando il chip nel carrier immediatamente e partendo perfusione costante con terreno di crescita. Tuttavia, si consiglia ammollo nel mezzo di crescita per tutta la notte, in quanto ha alcuni vantaggi: 1) crea un ambiente umido in modo che le piantine sono meno probabilità di diventare essiccata man mano che crescono nella camera di osservazione; 2) il chip è imbevuta di liquido, in modo degassamento (step 6.4) sarà più veloce. E &#39;importante utilizzare supporti con basse concentrazioni di soluto. Le soluzioni più concentrate possono precipitare e intasare i canali, specialmente se il chip viene utilizzato per diversi giorni. Una volta che il dispositivo è collegato alla linea di pressione dell&#39;aria, il flusso del fluido è controllata regolando la pressione idraulica nelle valvole. Per garantire la corretta chiusura delle valvole micromeccanici, è importante scegliere una pressione di comando che è circa tre volte superiore alla pressione del flusso. La pressione del flusso non deve superare i 15 psi come il fluido verrà spinto fuori delle bocche di radice. Pressioni più elevate ragazzoy anche causare delaminazione del chip, il che rende inutilizzabile chip. Una limitazione è che RootChip PDMS è poroso e idrofobo. Mentre il materiale è praticamente inerti di soluzioni acquose, può assorbire composti organici 12. Questo può interferire con un rapido scambio di soluzioni di composti organici potrebbe fuoriuscire dal materiale, anche quando la fornitura di questo composto è stato fermato all&#39;ingresso. A causa della porosità, che utilizza solventi organici può causare gonfiore del PDMS 12. Si continua a ottimizzare il RootChip ed estendere la sua utilità, ad esempio con radici delle piante coltivate. Siamo convinti che migliorando l&#39;accesso alla radice per i trattamenti e di osservazione, strumenti come la microfluidica RootChip aprirà nuove dimensioni della ricerca root.

<table border="1"><tbody><tr><td> Articoli </td><td> Fonte </td><td> Informazioni </td></tr><tr><td> Chip carrier, software e altre informazioni. </td><td> Carnegie Institution - DPB </td><td> File CAD e CNC per la fabbricazione del vettore, il software di controllo e ulteriori informazioni sono disponibili per il download dal sito <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip~~HEAD=NNS</a> portatori possono essere ordinati anche da questo sito. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Stanford Foundry </td><td> Disegni Maschera e protocolli di fabbricazione sono disponibili su richiesta. Ready-to-use RootChips può essere ordinato presso <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Chip di controllo </td><td> -Casa costruita-</td><td> Il sistema automatico di controllo della valvola è stato originariamente sviluppato da Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab. Un istruzioni dettagliate su come costruire il vostro proprio controllore valvola di azionamento può essere trovato alla <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging di fluorescenza della crescita root arabidopsis con manipolazione accelerato dell&#39;ambiente root usando il rootchip

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Le funzioni principali come l&#39;ancoraggio fisico della pianta ed è l&#39;organo responsabile per l&#39;assorbimento delle sostanze nutritive e di acqua minerale, quali elementi azoto, fosforo, solfato e la traccia che acquisiscono le piante dal terreno. Se vogliamo sviluppare approcci sostenibili alla produzione di colture ad alto rendimento, abbiamo bisogno di capire meglio come la radice si sviluppa, occupa un ampio spettro di nutrienti, e interagisce con gli organismi simbiotici e patogeni. Per raggiungere questi obiettivi, dobbiamo essere in grado di esplorare le radici in dettaglio microscopico su periodi di tempo che vanno da minuti a giorni. Abbiamo sviluppato il RootChip, un polidimetilsilossano (PDMS) - dispositivo basato su microfluidica, che ci permette di crescere e radici immagini da piantine di Arabidopsis evitando qualsiasi stress fisico alle radici durante la preparazione per l&#39;imaging 1 (figura 1). Il dispositivo contiene una struttura biforcata canale dotato di valvole micromeccanici per guidare il flusso del fluidoda insenature soluzione a ciascuno degli otto camere di osservazione 2. Questo sistema permette la perfusione microambiente radice da controllare e modificato con precisione e rapidità. Il volume delle camere è di circa 400 nl, richiedendo così soltanto quantità minime di soluzione campione. Qui forniamo un protocollo dettagliato per studiare la biologia root sul RootChip utilizzando l&#39;imaging basate su approcci con la risoluzione in tempo reale. Le radici possono essere analizzati più giorni utilizzando la microscopia lasso di tempo. Roots può essere perfuso con soluzioni nutritive o inibitori, e fino a otto giovani pianta possono essere analizzati in parallelo. Questo sistema ha il potenziale per una vasta gamma di applicazioni, compresa l&#39;analisi della crescita delle radici in presenza o assenza di sostanze chimiche, basato sulla fluorescenza analisi di espressione genica, e l&#39;analisi dei biosensori, ad esempio FRET nanosensori 3.

Questo articolo fornisce un protocollo per la coltivazione di piantine di Arabidopsis in RootChip, una piattaforma di imaging microfluidico che combina controllo automatizzato delle condizioni di crescita con il monitoraggio radice al microscopio e FRET-based misura i livelli di metaboliti intracellulari.

Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dell&#39;ambiente root usando il RootChip

La radice funge da ancoraggio fisico della pianta ed è l'organo responsabile dell'assorbimento di acqua e nutrienti minerali come l'azoto, ...

Per garantire rese massime, le piante devono ricevere una serie di nutrienti; carenze nutritive, stress come freddo o calore estremo, siccità o patogeni causano ogni anno ingenti perdite nella produzione agricola. L'origine di molti di questi problemi risiede spesso nel sottosuolo. La radice rappresenta l'ancoraggio fisico della pianta, ma è anche l'organo responsabile dell'assorbimento di acqua e di nutrienti minerali come azoto, solfato di fosforo e numerosi elementi in traccia.Se vogliamo sviluppare approcci sostenibili per ottenere rese colturali elevate, dobbiamo comprendere meglio come si sviluppa la radice, come assorbe questo ampio spettro di nutrienti e come interagisce con organismi simbiotici e patogeni. Per raggiungere questo obiettivo, dobbiamo essere in grado di esplorare le radici a livello microscopico, per motivi evidenti. Lo studio della biologia delle radici è sempre stato più complesso rispetto allo studio delle parti aeree della pianta.Poiché le radici sono solitamente nascoste sottoterra, non sono facilmente accessibili per studi microscopici. Il loro prelievo dal terreno provoca gravi danni al sistema radicale e pertanto non rappresenta un buon metodo per analizzarne il comportamento. Una soluzione per rendere le radici più accessibili consiste nel coltivarle su supporti agarizzati o, come mostrato in questo esempio, in mezzi idroponici.La coltivazione di piante su mezzi gelificati o su mezzi idroponici è stata utilizzata con grande successo in molti studi sulle radici, ma con questi metodi risulta ancora molto difficile analizzare le radici in dettaglio microscopico e per lunghi periodi di tempo. Per avvicinarci il più possibile alla radice in crescita ed evitare qualsiasi stress fisico derivante dalla preparazione per l'acquisizione delle immagini, abbiamo realizzato una piattaforma che ci consente di coltivare e osservare le radici, permettendoci al contempo di controllare e modificare il microambiente radicale con elevata precisione e rapidità. Questa piattaforma è stata chiamata root chip. Il root chip è un dispositivo microfluidico realizzato in PDMS, un polimero organico a base di silicone.Il chip presenta camere di osservazione per la crescita e l'analisi di radici provenienti da piantine di rabbit opsis. I semi germinano inizialmente in coni di plastica realizzati con le punte di pipetta, che riempiamo con un mezzo solido. L'apice radicale cresce quindi attraverso il mezzo e raggiunge la camera, dove viene mantenuto in condizioni di flusso continuo di mezzo liquido, conservando così le condizioni all'interno della camera.Le valvole micro meccaniche costanti sviluppate dal laboratorio di Steve Quake presso la Stanford University sono qui mostrate sotto controllo rosso. Poiché il chip è montato su un vetro di copertura trasparente, comunemente utilizzato per la microscopia, tutti i processi nella camera di osservazione possono essere monitorati al microscopio invertito. La struttura del canale biforcuto che indirizza il flusso del fluido è visibile al microscopio.Il chip radicale è composto da due strati: uno strato di controllo contenente le valvole e uno strato di flusso contenente i canali attraverso i quali i mezzi di crescita e le soluzioni di prova fluiscono verso le camere di osservazione. Il volume di queste camere è di circa 400 nanolitri. Ciò significa che sono necessarie solo quantità molto ridotte di soluzione e che le condizioni possono essere modificate molto rapidamente.Questo protocollo descrive come preparare le radici vive di otto o più piantine di Arabidopsis per l'analisi microscopica parallela sulla root chip e osservarle fino a tre giorni. Iniziare riempiendo una piastra di Petri da 10 millimetri con mezzo di crescita contenente agar all'1%. Mentre il mezzo è ancora liquido, riempire le punte da 10 microlitri con cinque microlitri di mezzo prelevato dalla piastra di Petri, utilizzando una pipetta multicanale. Le punte riempite vengono conservate nella scatola delle punte fino a quando il mezzo non si solidifica.Quindi si tagliano coni di plastica lunghi quattro millimetri e li si posiziona in posizione verticale in una piastra di Petri contenente un mezzo di crescita solido. Dopo la sterilizzazione della superficie, un singolo seme viene posizionato sulla sommità dei coni riempiti di mezzo. La piastra viene quindi sigillata con nastro microporoso e mantenuta a quattro gradi per sincronizzare la germinazione.Dopo tre giorni, le piastre vengono trasferite in un armadio di crescita per avviare la germinazione. Le nostre condizioni di crescita in questo esperimento sono di 23 gradi, con un ciclo di 16 ore di luce e 8 ore di buio. Tra cinque e sette giorni dopo la germinazione, la piantina dovrebbe essere pronta per il trasferimento nel chip radicale; si deve valutare la salute della piantina e la lunghezza della radice, e, se applicabile, si deve verificare l'espressione di un marcatore fluorescente al microscopio stereoscopico.Non appena le punte delle radici delle piantine raggiungono l'apertura inferiore del cono di plastica, singole piantine vengono contrassegnate per essere trasferite sul chip. Dovrebbero essere selezionate circa 10 piantine, nel caso in cui una si danneggi durante il trasferimento, per sterilizzare il chip radicale. Per esperimenti a lungo termine, il dispositivo viene avvolto in un tessuto, posto in una capsula di Petri di vetro e sterilizzato in autoclave.Questo chip è stato appena sterilizzato in autoclave. Dopo che il chip si è raffreddato, l'esperimento prevede di ricoprirlo con un mezzo di crescita liquido. Il chip deve essere completamente coperto, ma il livello del liquido non deve superare i tre millimetri rispetto alla superficie del chip.Una pipetta da 20 microlitri viene utilizzata per aspirare il mezzo attraverso l'ingresso radicale e l'uscita della camera. Questo riempie la camera di osservazione. Una volta selezionato il mezzo, ora vengono inseriti nel chip radicale coni di plastica. Il cono deve aderire perfettamente ai collegamenti in ingresso. Poiché il chip radicale è montato su uno strato sottile di vetro ottico, è necessario fare attenzione a non applicare troppa pressione sul chip. Durante questo passaggio, il chip è ora pronto per un'incubazione notturna nel mezzo liquido, al fine di impedire che il chip galleggi.Due vetrini, uno tagliato a metà, vengono posizionati sul chip. Si aggiunge una bacchetta magnetica da agitazione e si chiude la piastra. L'insieme viene quindi trasferito su un agitatore magnetico, che agiterà delicatamente il mezzo per favorire la crescita delle radici verso le uscite.Le entrate del chip radicale sono forate con un angolo per sostenere ulteriormente la crescita nella direzione desiderata. Inclinare leggermente l'assemblaggio sollevando il lato del chip opposto rispetto alle uscite.Il chip viene illuminato con una lampada ad anello collegata a un interruttore temporizzato per mantenere il ritmo luce-buio. Dopo l'incubazione notturna, il terreno di coltura liquido viene preparato in un vial sigillabile e pressurizzabile. I seguenti passaggi devono essere eseguiti rapidamente e senza interruzioni per evitare che le piantine si secchino.Il chip viene ora rimosso dal mezzo liquido e posizionato al contrario nell'apertura inferiore del portachiave, anch'esso capovolto. Il chip deve essere orientato in modo che il lato contenente gli ingressi dello strato di controllo sia rivolto verso il lato della linea di pressione. Due connettori grandi nella parete laterale del portachiave.Il vetrino sul fondo del chip viene asciugato tamponando delicatamente con carta da filtro e fissato al supporto. L'intero assemblaggio viene quindi capovolto utilizzando del nastro adesivo. I connettori per i tubicini vengono riempiti d'acqua mediante una siringa, e ciascun connettore viene inserito nell'apposito ingresso. Sul chip. I tubi vengono collegati al mezzo e alla soluzione. Le fiale e l'aria vengono quindi rimossi dalle linee applicando pressione alla soluzione biliare con una siringa d'aria; il supporto viene ricoperto con plastica trasparente.Per mantenere un'alta umidità nell'assemblaggio, il supporto viene posizionato sul piatto del microscopio. Deve adattarsi esattamente negli Intagli del piatto. Le valvole del chip, così come il flusso del mezzo attraverso il chip, sono controllate dalla pressione dell'aria.Due linee con regolatori si diramano da una linea principale di pressione. Una viene utilizzata per controllare il flusso del fluido e l'altra è collegata a valvole pneumatiche a solenoide. Queste valvole sono comandate dal computer tramite il controller USB per valvole e sono responsabili dell'azionamento delle valvole sul chip.Entrambi i regolatori di pressione devono essere chiusi prima di collegare il chip. I tubi, i connettori e le fiale di soluzione vengono ora collegati alle rispettive linee di pressione. Alcuni millilitri di acqua vengono aggiunti ai serbatoi del supporto.Questo passaggio potrebbe essere necessario ripeterlo nel corso di esperimenti più lunghi. Per mantenere l'umidità elevata, mantenere il volume caricato al minimo per ridurre al minimo la quantità di liquido che potrebbe versarsi sul microscopio. L'anello luminoso viene posizionato sopra il chip per mantenere il ciclo luce-buio fino all'inizio dell'esperimento.Le valvole sul chip vengono chiuse applicando pressione, in questo caso aprendo le valvole pneumatiche a solenoide. L'interfaccia LabVIEW consente il controllo delle valvole cliccando sul pulsante sotto il numero della valvola. Il verde brillante indica l'applicazione di pressione e la chiusura di una valvola del chip.Questo schema illustra l'organizzazione del sistema di valvole, in cui le valvole da quattro a otto funzionano come valvole singole, mentre le valvole da zero a tre operano in gruppi. In questo sistema, una singola camera può essere selezionata attivando una combinazione di valvole; ad esempio, per indirizzare il flusso del fluido esclusivamente alla terza camera a partire dall'alto, è necessario chiudere le valvole zero, tre e quattro. Inoltre, le valvole sei, sette e otto controllano quale soluzione viene utilizzata per il lavaggio degli ingressi A, B e C: ora attivare tutte e tre le valvole di ingresso della soluzione per chiuderle.L'interfaccia del controller presenta un anello di retroazione, che consente il monitoraggio dello stato del sistema. Questa funzione può essere attivata facendo clic sul pulsante di lettura. Il regolatore di pressione per lo strato di controllo viene aperto per primo e impostato a 15 PSI.Quindi il regolatore per lo strato di flusso viene aperto e impostato a cinque PSI. Viene aperta la valvola di ingresso per il mezzo di crescita scelto e le camere vengono lavate; i percorsi di flusso del mezzo devono essere controllati al microscopio. Nella maggior parte dei casi, l'aria rimane intrappolata nei canali e deve essere rimossa.Inoltre, i canali dell'aria di controllo contengono ancora aria che deve essere espulsa e sostituita con l'acqua proveniente dai connettori del tubo. Questo processo è chiamato riempimento a fondo cieco. Entrambe le operazioni vengono eseguite lavando più volte ciascuna delle otto camere fino a quando tutta l'aria viene espulsa dai canali nel PDMS.Il sistema può essere programmato per automatizzare esperimenti. Tali procedure possono essere utilizzate anche per disgasare il chip. La funzione principale del chip radice è quella di combinare una piattaforma di imaging e un sistema di perfusione in un unico dispositivo.Per dimostrare la manipolazione del microambiente delle radici, abbiamo lavato le camere con un colorante e misurato lo scambio di fluido all'interno delle camere. Alla pressione raccomandata di cinque PSI, abbiamo misurato uno scambio completo entro 10 secondi, con una portata calcolata di circa 1,5 microlitri al minuto. In questo caso, abbiamo inoltre osservato la crescita radicale di piantine coltivate al buio e fornite con 10 millimolari di glucosio come fonte esterna di energia.A seconda delle condizioni di crescita, come la luce e la composizione del mezzo, le piante possono essere osservate nel chip radicale per un massimo di tre giorni. Questo sistema è stato utilizzato per monitorare i livelli intracellulari di glucosio e galattosio nelle radici che esprimono nanosensori codificati geneticamente. Questi sensori, basati sul trasferimento di energia per risonanza o FRET, sono stati sviluppati nel laboratorio Frommer.Per questo esperimento, le radici all'interno del chip sono state perfuse con impulsi quadrati di soluzione di glucosio o galattosio. I livelli intracellulari degli zuccheri sono stati monitorati e sono mostrati qui, espressi come rapporto tra l'intensità del fluorocromo accettore citrina e l'intensità del donatore ECFP a sinistra. Osserviamo la quantità di sensori citrina al centro o l'immagine ratiometrica dell'apice radicale, e a destra tracciamo la quantità di zucchero come risposta a tre impulsi quadrati ripetuti di glucosio in verde e di galattosio in rosso.L'aumento del rapporto indica un accumulo di zucchero. I principali vantaggi del chip radicale rispetto ai metodi convenzionali di crescita sono la preparazione minimamente invasiva per la microscopia, la possibilità di modificare in modo reversibile e ripetuto l'ambiente radicale e la capacità di osservare continuativamente tessuti fisiologicamente sani e sviluppo-competenti per un periodo di giorni. Un altro vantaggio davvero importante è che sono necessarie solo piccole quantità di liquido per fornire alle radici tutti i nutrienti essenziali nel tempo.Questo rende il chip radicale molto conveniente, specialmente quando si utilizzano reagenti costosi. Continuiamo a ottimizzare il chip radicale e ad ampliarne l'usabilità perché riteniamo che, rendendo questo organo importante più accessibile per trattamenti e osservazioni, strumenti microfluidici come il chip radicale potranno potenzialmente aprire nuove prospettive nella ricerca vegetale. Ulteriori informazioni su come costruire un sistema di chip radicale sono disponibili sul nostro sito web.I chip possono essere ordinati presso il Stanford Foundry.

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