Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come visualizzare in modo non invasivo i linfatici in piccoli animali utilizzando un sistema di imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso. Ciò si ottiene ricostituendo il colorante fluorescente alla concentrazione appropriata immediatamente prima dell'imaging. Successivamente, l'animale sedato viene iniettato per via intradermica con il colorante nella posizione.

Ciò consentirà la visualizzazione dei vasi linfatici di interesse nella fase finale. Le immagini dei vasi vengono acquisite e quindi analizzate. In definitiva, vicino all'infrarosso.

L'imaging linfatico fluorescente può essere utilizzato per dimostrare e rivelare la funzione e l'architettura del sistema vascolare linfatico. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sul ruolo che il sistema linfatico svolge negli animali sani. Può anche essere applicato in una varietà di condizioni patologiche come metastasi tumorali, risposta immunitaria acuta e cronica, guarigione delle ferite e transgenica.

Modelli di disturbi linfatici associati Il giorno dell'imaging iniziare ricostituendo l'incy e il verde con acqua sterile, quindi diluire con soluzione fisiologica normale fino a una concentrazione di 645 micromolari. Quindi, dopo aver regolato il cono del naso sull'animale sedato, spegnere le luci se necessario. Una piccola lampada Hagen da tavolo può essere utilizzata per vedere per le iniezioni.

L'aspetto più difficile di questa procedura è l'iniezione dei topi per via cutanea anziché sottocutanea nella posizione corretta per l'assorbimento da parte dei vasi linfatici che devono essere visualizzati. Per garantire il successo, acquisire due o tre immagini di base per confermare la posizione dei vasi linfatici in ciascun animale prima di iniziare l'esperimento. Ora usa una siringa da insulina con un ago calibro 31 per iniettare 10 microlitri di colorante nella parte sinistra della base della coda per visualizzare i linfatici che drenano dalla regione inguinale alla regione ascellare in generale.

Per visualizzare il lato sinistro dell'animale, iniettare nella posizione 5, 6, 9 o 10. Per visualizzare il lato destro, iniettare il colorante nelle posizioni 7, 8, 11 o 12, da una a quattro, forse due inferiori sulla coda per un assorbimento ottimale per visualizzare il drenaggio linfatico dalla regione inguinale alla regione ascellare. Se l'animale non è sotto il sistema di imaging durante l'iniezione, posizionarlo immediatamente dopo.

Successivamente, coprire il sito di iniezione con carta nera per aiutare a osservare i vasi linfatici utilizzando il software v plus plus e un sistema di imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso di piccoli animali. Acquisisci immagini linfatiche per un massimo di un'ora. Infine, consenti agli animali di riprendersi su un cuscinetto termico per coccole e poi riportali nella loro gabbia, mentre sono disponibili in commercio imager fluorescenti a infrarossi per piccoli animali.

In questo video, è stato utilizzato un sistema di imaging Nerf personalizzato per piccoli animali costituito da un diodo laser da 785 nanometri dotato di un diffusore e un filtro per lenti asferiche per creare un campo di eccitazione uniforme che illumina l'animale a una velocità di fluenza incidente inferiore a 1,4 milliwatt per centimetro quadrato e per catturare immagini linfatiche viene utilizzato un sistema di telecamere a coppia di carica moltiplicatrice di elettroni con 2 filtri da 830 nanometri e una lente NYCO da 28 millimetri con tempi di integrazione di 200 millisecondi per l'imaging dinamico e fino a 800 millisecondi per l'imaging statico della linfa fluorescente. Quando il peptide IR 800 viene iniettato per via intradermica alla base della coda di un topo normale. La vascolarizzazione linfatica tra il sito di iniezione alla base della coda e il linfonodo inguinale deve essere immediatamente visualizzata entro pochi secondi o minuti dopo l'iniezione.

Il vaso linfatico tra il linfonodo inguinale e il linfonodo ascellare dovrebbe essere visualizzato come si vede qui poiché i linfatici nei topi variano da animale ad animale come negli esseri umani. Si possono vedere variazioni nell'architettura tra gli animali, come dimostrato in questa figura. Questi pannelli mostrano le immagini ottenute il giorno della prima iniezione e questi pannelli mostrano le immagini ottenute due giorni dopo, il giorno della seconda iniezione, utilizzando gli stessi topi e lo stesso protocollo di imaging.

Mentre l'architettura linfatica varia tra il topo 1 24 e il topo 1 28, le immagini ottenute utilizzando l'imager a fluorescenza nel vicino infrarosso sono coerenti per ogni topo. Il primo e il terzo giorno, quando l'agente di imaging viene iniettato per via intradermica sulla faccia dorsale della zampa posteriore di un topo normale, è possibile visualizzare due vasi linfatici che drenano verso il linfonodo popliteo come mostrato qui. In alcuni casi, è difficile distinguere entrambi i vasi a causa della loro vicinanza, come illustrato in questo ingrandimento dell'immagine dell'arto posteriore dell'animale.

Per il topo rappresentativo mostrato qui, 10 microlitri di ICG sono stati iniettati nella faccia dorsale della zampa posteriore sinistra e nel lato sinistro della base della coda. A volte, la visualizzazione dei linfatici è ritardata più comunemente a causa del fatto che l'iniezione viene somministrata per via sottocutanea anziché intradermica. Quando vengono somministrate iniezioni sottocutanee, il trasporto linfatico potrebbe non essere immediatamente visualizzato, come illustrato in questa immagine, a causa del tempo aggiuntivo necessario affinché il colorante raggiunga e venga assorbito dai capillari linfatici della pelle.

Pertanto, è importante fare attenzione che il colorante venga iniettato per via intradermica e non sottocutanea. A volte si osservano anomalie dei vasi linfatici. Ad esempio, in questa immagine sul lato non ferito dell'animale, è possibile visualizzare il linfonodo inguinale e il vaso linfatico EENT relativamente dritto che drena verso i linfonodi ascellari sul lato danneggiato del topo.

Tuttavia, la normale vascolarizzazione linfatica è stata interrotta a causa di ferite e appare aberrante a causa della riparazione tissutale acquisita, le immagini dei vasi linfatici visualizzati possono essere caricate nell'immagine J o in MATLAB per l'analisi dei dati. Come mostrato in queste immagini, le regioni circolari di interesse ad area costante vengono selezionate o disegnate lungo l'intera lunghezza del vaso linfatico fluorescente. Nell'imaging linfatico umano e animale, una regione di interesse viene selezionata in modo tale che il suo diametro sia approssimativamente il diametro dell'immagine del vaso fluorescente.

L'intensità media della fluorescenza all'interno di ciascuna regione di interesse viene quindi tracciata in funzione del tempo di imaging per valutare la velocità propulsiva e la frequenza dei pacchetti di linfa carica di dia spinti lungo i vasi linfatici. Le perturbazioni nell'intensità della fluorescenza attraverso le ROI rappresentano un impulso linfatico che si propaga attraverso le regioni di interesse e sono parallele alle frecce per valutare la velocità di propagazione linfatica e la frequenza della propulsione linfatica. Vengono selezionate due regioni di interesse con valori massimi o variazioni di intensità fluorescente chiaramente definite che rappresentano la propagazione di pacchetti di linfa e vengono tracciati i loro profili di intensità fluorescente, come si può osservare in questi due grafici.

La velocità di propagazione viene calcolata prendendo il rapporto tra la distanza tra le due regioni di interesse e il tempo di transito di un pacchetto di linfa per propagarsi tra di loro. Valutando il numero di impulsi fluorescenti o pacchetti che arrivano in una singola regione di interesse per volta, la frequenza contrattile viene calcolata dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per chiarire in modo non invasivo e longitudinale il ruolo del sistema linfatico in una varietà di malattie in condizioni di salute.