Tutta la Monte RNA fluorescente In situ L'ibridazione di Drosophila Embrioni

Questa procedura descrive un metodo fish ottimizzato per valutare le caratteristiche di espressione e localizzazione dell'RNA in embrioni di Drosophila a montatura intera. Ciò si ottiene sintetizzando prima una sonda di RNA marcata, complementare a un RNA di interesse Mr NA o non di rivestimento, mediante trascrizione in vitro di un modello di DNA opportunamente selezionato. Parallelamente vengono utilizzate gabbie per la popolazione di mosche per raccogliere, fissare e permeare gli embrioni dello stadio di sviluppo desiderato.

Dopo diverse fasi di post-fissazione, gli embrioni vengono ibridati con la sonda di RNA antisenso marcata. Infine, dopo un ampio lavaggio dei campioni, la sonda ibridata viene rilevata mediante marcatura immunologica con un anticorpo specifico e reagenti di rilevazione coniugati con fluorocromo, fornendo così una lettura sensibile della distribuzione dell'RNA bersaglio. In definitiva, i risultati producono segnali fluorescenti ad alta risoluzione che vengono analizzati mediante microscopia a fluorescenza standard al fine di documentare le caratteristiche di espressione spaziale e temporale dell'RNA bersaglio durante l'embriogenesi della Drosophila.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il Northern blot o R-T-P-C-R è che si può valutare l'espressione dell'RNA all'interno di campioni di tessuto intatto. Sebbene questo metodo sia destinato all'analisi delle proprietà di espressione dell'RNA negli embrioni precoci di Drosophila, può essere impiegato anche per l'analisi di embrioni nelle fasi successive dello sviluppo di tessuto sezionato da larve o moscerini adulti. Un aspetto importante della nostra procedura è l'aumento del numero di campioni che possiamo ottenere eseguendo il pesce in posizione PCR, il che aumenta sostanzialmente la produttività dell'approccio.

I membri del laboratorio che dimostrano questa procedura includono resistenza alla ricerca universitaria, studenti laureati e borsisti post-dottorato. Inizia con gabbie per la popolazione ben nutrite. Sostituisci il piatto con un piatto di lievito di succo di mela e lascia le mosche per un'ora a 25 gradi Celsius.

Quindi sostituire la piastra di lievito per succo di mela per raccogliere gli embrioni in fase iniziale. Incubare la gabbia a 25 gradi Celsius e attendere fino a quando non è stato raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato degli embrioni in attesa in una cappa chimica, mescolare le sostanze chimiche per produrre il 37% di formaldeide in una fiala di vetro per inalazione. Far bollire la soluzione fino a quando la polvere di PFA non è completamente sciolta.

Quindi raffreddarlo a temperatura ambiente e filtrarlo in una nuova fiala di scintillazione. Quindi, preparare una soluzione di fissazione bifasica. Combinare il PBS con il 37% di formaldeide in una fiala di scintillazione, quindi aggiungere l'eptano quando è pronto.

Raccogli gli embrioni dalla piastra di succo di mela a temperatura ambiente, acqua del rubinetto e spazza delicatamente con un pennello fine. Trasferisci gli embrioni risospesi in un cestello e sciacquali con acqua tiepida del rubinetto. Ora decappare gli embrioni per 90 secondi bagnando il cestello in una soluzione fresca di candeggina al 3%.

Quindi rimuovere la candeggina con acqua tiepida del rubinetto fino a quando l'odore di candeggina non è scomparso. Per raccogliere gli embrioni, smontare il cestello di raccolta e trasferire delicatamente gli embrioni nella soluzione di fissazione bifasica. Usando il pennello, gli embrioni si accumuleranno all'interfaccia tra gli strati di PBS ed eptano.

A questo punto sigillare le fiale di scintillazione, fissarle a un miscelatore a vortice e agitarle per 20 minuti alla temperatura più bassa. Dopo l'agitazione, scartare la maggior parte della PBS inferiore e delle fasi superiori dell'heane utilizzando una pipetta da pascolo. Quindi aspirare la miscela rimanente nella pipetta ed eliminare con cautela la fase inferiore senza perdere gli embrioni.

Depositare gli embrioni in una provetta da 1,5 millilitri contenente una soluzione bifasica di 500 microlitri di eptano e 500 microlitri di metanolo. Agitare energicamente il tubo per 30-45 secondi per rompere le membrane rotulee. Una volta incrinati, gli embrioni affonderanno nel metanolo.

Scartare la fase superiore e gli embrioni non incrinati e aggiungere un millilitro di metanolo. Ora agitare brevemente la provetta per cinque secondi e lavare gli embrioni tre volte con metanolo. Dopo i lavaggi, gli embrioni possono essere conservati per diversi mesi a meno 20 gradi Celsius.

Iniziare aggiungendo 500 microlitri di PK a ciascuno degli embrioni e incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Prestare molta attenzione a danneggiare i campioni digerindoli eccessivamente con proteine a k o attraverso una manipolazione sciatta. Durante l'incubazione PK, mescolare gli embrioni ogni due minuti spruzzandoli con una pipetta.

Dopo 10 minuti, metti gli embrioni in ghiaccio per un'ora. Dopo un'ora, rimuovere la soluzione PK a temperatura ambiente. Lavare gli embrioni due volte con glicina in PBT per due minuti.

Ora, fissare i campioni per 20 minuti in un millilitro di formaldeide al 3,7% in PBT con oscillazione. Lavare via la formaldeide con cinque risciacqui in PBT. Quindi sciacquare gli embrioni con un millilitro di soluzione di PBT e HI di uguali volumi e sostituire la miscela con 0,5-1 millilitro di soluzione pura.

A questo punto, gli embrioni possono essere conservati per diversi giorni o settimane a meno 20 gradi Celsius. In una piastra da 96 pozzetti, aliquotare da 10 a 15 microlitri di embrioni sedimentati per pozzetto. Utilizzare una punta a foro largo per evitare di danneggiare gli embrioni.

Ora prepara la soluzione di pre-ibridazione facendo bollire 100 microlitri di soluzione hype per campione. Bene per cinque minuti, raffreddare la soluzione Pre-Hype con ghiaccio per cinque minuti, quindi aggiungere 100 microlitri di essa a ciascun pozzetto della piastra, che contiene i campioni di embrioni. Recuperare la sonda di RNA preparata e quantificata da uno spettrofotometro NanoDrop.

Inoltre, per verificare la qualità della sonda, passarne uno o due microlitri su un gel agro. Ora per ogni campione, diluire circa 100 nanogrammi di sonda in 100 microlitri di soluzione HI. È fondamentale lavorare in condizioni prive di RNA.

Quando si maneggia la sonda. Riscaldare la soluzione a 80 gradi Celsius per tre minuti. Quindi raffreddarlo con ghiaccio per almeno cinque minuti.

Può essere mantenuto in frigorifero per diverse ore. Recuperare la piastra e rimuovere la soluzione Pre-Hype dagli embrioni mediante aspirazione. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione hype con la sonda RNA a ciascuno.

Ibridare bene la sonda a 56 gradi Celsius per 12-16 ore il giorno successivo. Una serie di cinque soluzioni viene preriscaldata a 56 gradi Celsius. Il primo è pura soluzione per l'hype e l'ultimo è puro PBT.

Gli altri tre sono la diluizione di HI in PBT. Una volta riscaldati, sciacquare rapidamente i campioni una volta in una soluzione pura di hype. Successivamente, eseguire tre lavaggi di 15 minuti, iniziando con la soluzione di hype meno diluita seguita da ciascuna delle diluizioni successive.

Infine, lavare i campioni quattro volte per cinque minuti in PBT puro. Quindi portare i campioni a temperatura ambiente. Ora procedi con le applicazioni di anticorpi per rilevare la sonda e migliorare la miscelazione del campione.

Durante queste fasi, la piastra può essere collocata in una piccola scatola che è attaccabile a un mixer mutante utilizzando il protocollo descritto, il classico gene della regola di coppia runt è stato analizzato in fasi distinte dell'embriogenesi. L'analisi dei pesci ha rivelato come l'ampia espressione iniziale nella porzione centrale dell'embrione al quarto stadio embrionale sia raffinata in un modello a strisce segmentate. Nelle fasi successive, il pesce è stato eseguito utilizzando varie sonde di RNA antisenso e antisenso marcate ibridate in embrioni di drosophila di età compresa tra zero e quattro ore.

Le sonde ibridate sono state rilevate mediante incubazioni sequenziali con un antigene biotinilato e anticorpi streptococco avido in HRP e Ceramide. I campioni sono stati montati e analizzati mediante microscopia a fluorescenza. Un ampio mosaico di risultati di pesce è stato osservato in questi embrioni di stadio da quattro a sette Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare precauzioni in varie fasi, come proteggere le sonde di RNA e la degradazione lavorando in condizioni prive di RNA e utilizzando forniture prive di RNA.

Una volta padroneggiate queste basi, è possibile aggiungere ulteriori passaggi al metodo per eseguire l'esperienza di marcatura multipla al fine di visualizzare diversi RNA o marcatori proteici specifici nello stesso campione. Dopo aver visto questo video, avrai una buona idea di come eseguire l'ibridazione fluorescente in C 2 per documentare l'espressione o le dinamiche di localizzazione subcellulare del tuo RNA preferito durante l'embriogenesi di Drosophila Happy Fishing.