In vitro organoide Cultura di primari tumori del colon mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire organoidi tumorali del colon a neurone primario. Ciò si ottiene raccogliendo prima il tessuto tumorale del colon di topo. Il secondo passo consiste nel dissociare l'epitelio del colon normale adiacente.

Successivamente, le cellule tumorali del colon vengono digerite in singole cellule. Il passaggio finale consiste nell'incorporare le cellule tumorali del colon nel matrigel e coltivarle selettivamente con condizioni nutrizionali limitate. In definitiva, la microscopia ottica viene utilizzata per mostrare il decorso temporale della formazione di un organoide tumorale del colon.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le linee cellulari di cancro del colon trasformate, è che le colture di organoidi imitano da vicino lo stato in vivo e generano dati più rilevanti dal punto di vista fisiologico. Dopo aver soppresso il topo con anidride carbonica e raccolto il colon, sciacquare il colon con PBS. Usa le forbici per aprire il colon longitudinalmente, quindi posizionalo sotto uno stereomicroscopio e usa le forbici per rimuovere le regioni contenenti tumori.

Raccogliere e lavare il tessuto tumorale con PBS. Dopo il lavaggio, trasferire i frammenti intestinali nella chelazione EDTA, tamponare e incubare su ghiaccio per 60 minuti dopo la chelazione, la maggior parte delle normali cellule epiteliali intestinali verrà staccata mentre le cellule tumorali rimarranno attaccate al mechimè. Aspirare il tampone chelante contenente cellule epiteliali normali e lavare i frammenti tumorali rimanenti.

Ancora una volta. Con cinque millilitri di tampone di chelazione a freddo. Dopo aver aspirato il tampone chelante, lavare i frammenti tumorali con cinque millilitri di XPBS freddo.

Dopo aver aspirato l'unico XPBS, aggiungere un tampone di digestione ai frammenti di tessuto e incubare per due ore. A 37 gradi Celsius, lasciare che i frammenti tumorali si depositino sotto la normale gravità per un minuto e poi raccogliere il surnatante S in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Pellettare la sospensione tumorale a cellula singola supinata centrifugando a 200 volte G per tre minuti.

Quindi lavare una volta con cinque millilitri di PBS e centrifugare. Anche in questo caso, risospendere il pellet tumorale con 500 microlitri di PBS. Quindi contare le singole cellule tumorali isolate utilizzando un emocitometro.

Quindi, avvolgere le cellule tumorali centrifugando a 200 volte G per tre minuti e inviare nuovamente cinque milligrammi per millilitro di matrigel su ghiaccio. Quindi piastra 15.000 cellule in un volume di 50 microlitri di matrigel per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Dopo aver lasciato polimerizzare la miscela di cellule matrigel per 15 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura basale contenente 50 nanogrammi per millilitro di EGF nelle urine a ciascun mezzo di coltura basale contenente EGF ogni due giorni e massaggiare gli organoidi da uno a cinque una volta alla settimana per massaggiare.

Dopo aver sostituito il terreno di coltura con un terreno basale fresco, utilizzare una pipetta P 1000 con una punta di pipetta tagliata per interrompere meccanicamente gli organoidi e il matrigel. Trasferire la sospensione organoide in una provetta di falco da 15 millilitri. Utilizzare una pipetta per pasta lucidata a fuoco per interrompere ulteriormente gli organoidi.

Lavare gli organoidi dissociati con cinque millilitri di coltura basale, terreno e centrifugare 200 volte G per due minuti. Quindi scartare il supinato, risospendere il pellet con matri gel e piastra come descritto in precedenza per congelare gli organoidi, dissociare, lavare e centrifugare. Come prima, scartare il supinato e risus.

Sospendere il pellet in DMEM contenente il 20% di siero fetale bovino e il 10% di ossido di dimetilsolfolfato. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in provette criogeniche da 1,5 millilitri. Trasferire i tubi in un contenitore di congelamento Nalgene Mr.Frosty e conservarli in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per ottenere una velocità di raffreddamento di meno un grado Celsius al minuto.

Dopo l'incubazione notturna, trasferire le cellule in azoto liquido. Le celle possono essere conservate in questo modo per oltre due anni. Per l'estrazione dell'RNA, le cellule vengono raccolte.

Per quanto riguarda il passaggio, l'RNA viene isolato utilizzando il kit di isolamento dell'RNA puro pico. Secondo le istruzioni del produttore per l'estrazione delle proteine, il pellet cellulare viene raccolto nel modo consueto e poi giace in 100 microlitri di tampone per il saggio di immunoprecipitazione radio per l'immunoistochimica. Dopo aver aspirato il terreno di coltura cellulare, utilizzare una pipetta P 1000 tagliata per trasferire gli organoidi tumorali in uno stampo criogenico.

Posizionare lo stampo su ghiaccio secco e aggiungere un mezzo di congelamento dei tessuti allo stampo, tagliare le sezioni congelate a sette micron e colorare Secondo i protocolli precedentemente pubblicati, questa immagine mostra una formazione di organoide rappresentativa derivata da un tumore del colon prelevato da un topo di tre mesi, un topo PC min, poco dopo la placcatura. Questa immagine mostra lo stesso organoide un giorno dopo la piastratura. Qui, l'organoide è stato in coltura per tre giorni.

Mentre questa immagine mostra l'organoide sei giorni dopo la placcatura. Qui vengono mostrati due organoidi che sono stati in coltura per 14 giorni. Si noti che in questa fase, ogni organoide è costituito da un gruppo di cellule.

Questo istogramma mostra il tasso di successo della formazione di organoidi in due diverse condizioni di digestione della collagenasi. Queste immagini mostrano organoidi derivati da un tumore del colon prelevato da un topo di tre mesi, un topo PC min con colorazione immunofluorescente per beta-catenina. La DPI è stata utilizzata per colorare i nuclei.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire l'OID del tumore del colon nelle urine primarie mediante digestione enzimatica.