Bioluminescente modello ortotopico di cancro al pancreas Progressione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare un modello murino ortotopico di cancro al pancreas che utilizza l'imaging a bioluminescenza in vivo per monitorare in modo non invasivo lo sviluppo del tumore. Ciò si ottiene sospendendo per la prima volta le cellule tumorali marcate con luciferasi in Matrigel. Il secondo passo consiste nell'eseguire una laparotomia per aprire la cavità addominale e localizzare e fissare il pancreas.

Successivamente, una sospensione di cellule tumorali in matrigel viene iniettata nel pancreas. Il passaggio finale consiste nel sostituire il pancreas e utilizzare punti di sutura per chiudere la cavità addominale. In definitiva, l'imaging a bioluminescenza viene utilizzato per monitorare la progressione del tumore e tracciare la risposta agli interventi terapeutici.

Il vantaggio principale di questo modello rispetto ai saggi cellulari in vitro o ai modelli sottocutanei di cancro del pancreas è che ci consente di studiare le interazioni tra le cellule tumorali del pancreas e il microambiente pancreatico. La cinetica della progressione della malattia in questo modello è altamente riproducibile e si verifica in un breve lasso di tempo, rendendo questo modello utile per l'esame di nuove terapie nel cancro del pancreas, la cui dimostrazione di questo modello è davvero fondamentale. Poiché l'iniezione di cellule tumorali deve essere eseguita con attenzione per evitare perdite, per iniziare questa procedura, la coltura.

Le cellule tumorali del pancreas che sono state trasdotte per esprimere la luciferasi come descritto nel protocollo scritto fino a quando non sono confluenti al 70%, quindi raccogliere le cellule con lo 0,05% di tripsina EDTA e contarle utilizzando un emocitometro, assicurarsi che la vitalità sia maggiore del 90% Quindi, pellettare le cellule centrifugando delicatamente a 200 volte la gravità per cinque minuti dopo la centrifugazione, Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule tumorali del pancreas a 20 milioni di cellule per millilitro. In una miscela tre a due di matrigel e PBS freddo, mettere il composto sul ghiaccio. Quindi utilizzando una siringa da insulina da 0,3 millilitri calibro 29

Aspirare la sospensione cellulare matrigel preparata nella siringa. Per iniziare questa procedura, anestetizzare il topo utilizzando isoflurano inalato dal 2 al 3%. Dopo uno o due minuti, controllare la profondità dell'anestesia pizzicando delicatamente la punta del mouse per verificare la mancanza di riflesso del pedale.

Successivamente, applicare una quantità sufficiente di lubrificante su ciascun occhio per prevenire l'essiccazione durante l'intervento chirurgico. Quindi posiziona il mouse sul retro su un termoforo a 37 gradi Celsius e ruota delicatamente il mouse per sollevare il lato sinistro dell'addome. Una volta orientato correttamente, preparare l'addome del topo per l'intervento chirurgico.

Utilizzando strumenti chirurgici sterili, praticare un'incisione di 1,5 centimetri attraverso la pelle a circa due millimetri a sinistra laterale dalla linea mediana. Quindi praticare un'incisione di 1,5 centimetri nel muscolo addominale sottostante. Quindi, individua la milza usando una pinza sterile e rimuovila delicatamente per la cavità addominale.

Fissare la milza lungo un batuffolo di cotone sterile per esporre il pancreas sottostante. Quindi individuare la coda del pancreas adiacente alla milza resus. Sospendere la sospensione cellulare matrigel e iniettare 20 microlitri nella coda del pancreas dopo l'iniezione.

Tenere la siringa in posizione per 30-60 secondi fino a quando il matrigel non ha avuto il tempo di solidificarsi, questo passaggio importante riduce al minimo la perdita di cellule. Dopo aver rimosso l'ago, ispezionare il sito di iniezione per assicurarsi che non si siano verificate perdite. Quindi riportare la milza e il pancreas nella cavità addominale.

Chiudere la muscolatura addominale del topo con una sutura a quattro auto intrecciata riassorbibile con un ago rotondo utilizzando un punto continuo. Successivamente, chiudere la pelle esterna con un monofilamento non assorbibile. Sei suture automatiche con un ago da taglio utilizzando un punto continuo e applicare Betadine.

Quindi rimuovere il topo dall'anestetico inalato e iniettare tra 0,05 e 0,1 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina per via sottocutanea. Come analgesico postoperatorio, consentire al topo di riprendersi nella sua gabbia, posizionata su un termoforo a 37 gradi Celsius con libero accesso a cibo e acqua. Continuare a monitorare attentamente il mouse per i primi giorni dopo l'intervento chirurgico.

Se il topo mostra segni di dolore come curvatura o mobilità ridotta, la buprenorfina può essere somministrata per via sottocutanea ogni 12 ore per un periodo di 36 ore. Dopo che il sito chirurgico è guarito in sette-10 giorni, anestetizzare il topo e rimuovere le suture esterne. Per iniziare il tracciamento bioluminescente delle cellule tumorali del pancreas.

Anestetizzare nuovamente il topo utilizzando dal 2 al 3% di fluoro inalato e applicare del lubrificante sugli occhi per evitare che si secchino e muoiano. Una volta anestetizzato, iniettare 150 milligrammi per chilogrammo di Lucifero tramite iniezione della vena caudale e lasciare che uno o due minuti il luciferino si faccia strada verso le cellule. Posizionare il mouse sul lato destro del sistema di imaging bioluminescente in modo che il tumore sia rivolto verso la telecamera.

Qui stiamo usando il sistema di imaging Illumina two. Quindi acquisisci immagini a luce bianca e bioluminescenza utilizzando il software di imaging, come descritto in precedenza in altri articoli JOV. Una volta completato l'imaging, rimuovere il topo dall'anestetico inalato e lasciarlo riprendersi nella sua gabbia domestica.

Ripetere questi passaggi per tutta la durata della crescita del tumore al fine di studiare la crescita del tumore. Cinetica. L'uso di linee cellulari marcate con luciferasi fornisce un modo unico per misurare la crescita del tumore. In modo non invasivo. Qui è mostrato un topo 10 giorni dopo l'iniezione con un tumore relativamente piccolo, 31 giorni dopo l'iniezione in cui il tumore si è ingrandito e cinque giorni dopo che il tumore è stato resecato.

La bioluminescenza osservata in questa immagine mostra la recidiva del tumore pancreatico cinque giorni dopo la resezione, nonché metastasi al fegato vicino. Il grafico mostrato qui mostra tassi di crescita simili per il metodo di iniezione di cellule matrigel. Descritto in questo video ha confrontato un altro metodo in cui i pezzi di tumore pancreatico vengono trapiantati.

Cinesiche di crescita simili possono essere osservate sia per quello pan che per quello capin. Le linee cellulari dopo il sacrificio, la colorazione H e d sono state eseguite per mostrare la natura invasiva delle cellule tumorali del pancreas nel tessuto pancreatico circostante mostrato qui indicato dalle stelle gialle e metastasi in altri organi, incluso il fegato mostrato qui. Una volta padroneggiato, questo metodo può essere eseguito in circa 10 minuti.

Inoltre, la visualizzazione biocentesimale della progressione della malattia metastatica e ricorrente rende questo modello clinicamente rilevante poiché attualmente la maggior parte delle terapie antitumorali sono palliative.