Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron

Per conservare processi neuronali per l'analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere i neuroni primari di ratto in modo tale che i loro neuroni siano adatti alla visualizzazione mediante microscopia crioelettronica. Ciò si ottiene preparando prima i piatti con griglie EM per la placcatura dei neuroni primari. Il secondo passo consiste nel preparare e placcare i neuroni primari sulle griglie EM.

Successivamente, viene eseguita la vetrificazione dei neuroni sulle griglie EM. Il passaggio finale consiste nella raccolta delle immagini mediante microscopia crioelettronica, seguita dalla post-elaborazione e dall'annotazione. In definitiva, la microscopia crioelettronica e la tomografia vengono utilizzate per mostrare l'ultrastruttura dei neuriti in uno stato di congelamento idrato.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che può essere utilizzata per la visualizzazione 3D di neuriti idratati congelati a risoluzione nanometrica senza l'uso di fissativi chimici. Facilitando quindi la valutazione delle caratteristiche morfologiche più vicine allo stato nativo. Iniziate questa procedura esaminando l'integrità del carbonio sacro sulle griglie EM d'oro.

Utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento di almeno 25 volte, assicurarsi che i fori di carbonio siano più grandi del 98% intatti. Per placcare, i neuroni primari utilizzano un bruciatore Bunsen per sterilizzare a fiamma le griglie EM e renderle contemporaneamente idrofile. Trasferire immediatamente la griglia con il lato in carbonio fino al centro del vetro.

Piatto inferiore, posizionare una griglia EM per piatto e utilizzare solo piatti con fondo in vetro pre-sterilizzati. Quindi, utilizzare un microscopio ottico per verificare l'integrità della griglia mantenendo la griglia EM all'interno della piastra inferiore in vetro in una cappa di coltura tissutale, applicare 250 microlitri della sostanza di rivestimento appropriata sull'area centrale del vetro della capsula di Petri. Lentamente e con attenzione, assicurarsi che la sostanza di rivestimento appropriata copra l'intera griglia E EM.

Successivamente, coprire la capsula di Petri con il coperchio e incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, aspirare tutta la miscela di poliolo lisina dalle piastre con una punta di pipetta sterile attaccata al tubo a vuoto nella cappa. Evitare il contatto diretto con la rete E EM.

Successivamente, utilizzare una pipetta a spostamento d'aria regolabile per applicare con cura 250 microlitri di PBS sterile per coprire completamente la griglia EM nell'area centrale del vetro di ciascuna piastra di Petri. Quindi aspirare il PBS da ogni piatto. Ripetere la procedura tre volte dopo.

Lasciare asciugare le piastre con griglie EM nella cappa di coltura tissutale per 15 minuti. Controllo al microscopio ottico. Assicurati che siano completamente asciutti e che non ci siano bolle di umidità nella griglia.

In caso contrario, aspirare con cura accanto alla griglia EM per eliminare questa umidità in eccesso, la griglia rivestita deve essere utilizzata immediatamente per placcare i neuroni. In questa procedura, calcolare il volume appropriato di cellule per ogni piatto al fine di ottenere una concentrazione di 50.000 cellule per millilitro per piatto. La quantità massima di applicazione dovrebbe essere di 250 microlitri per riempire solo l'area centrale del vetro, non l'intero piatto.

Successivamente, incubare le piastre per 30 minuti in un incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di riprendersi e aderire, dopo 30 minuti, aggiungere lentamente 1,5 millilitri di terreno cellulare riscaldato a ciascuna piastra ed evitare di toccare la griglia EM per i neuroni dell'ippocampo. Cambia il supporto il giorno successivo e poi cambia metà del supporto ogni due giorni per 14 giorni. In questa procedura, preparare l'attrezzatura e tutti i materiali per il congelamento e la conservazione delle griglie EM d'oro a temperatura criogenica, che includono un dispositivo di vetrificazione con una camera di umidità, carta da filtro priva di calcio, un paio di pinzette a punta piatta lunga, un paio di pinzette specializzate a punta fine per la macchina di vetrificazione, un agente di azoto liquido, un contenitore del refrigerante e la scatola di stoccaggio della rete EM.

Quindi accendere il dispositivo di vetrificazione. Impostare l'umidità al 100% e la temperatura a 32 gradi Celsius. Nella sezione delle opzioni, imposta il tempo di blocco su zero secondi.

Ciò consente l'asciugatura manuale attraverso la finestra laterale della camera di umidità. Quindi impila tre carte da filtro prive di calcio. Taglia la pila in strisce larghe 0,5 centimetri lunghe circa due centimetri, dopodiché piegale con un angolo di 90 gradi in modo tale che una sezione della carta sia di 0,5 centimetri per 0,5 centimetri.

Questa sezione verrà utilizzata per tamponare il campione. Rimuovi la carta centrale e posizionala su un'altra carta da filtro senza calcio fino al momento dell'uso. Quindi, usa la vitrificazione specializzata per le pinzette per prelevare con cura la griglia EM dal piatto.

Nota il lato della griglia EM su cui crescono i neuroni, poiché la posizione sarà importante per il passaggio successivo. Quindi utilizzare il blocco scorrevole nero sulle pinzette per bloccare saldamente le pinzette sulla griglia EM. Ora inserisci le pinzette nella macchina di vitrificazione in modo tale che il lato della griglia EM su cui sono aderenti i neuroni sia rivolto a sinistra e lontano dal foro di apertura circolare sul lato della macchina di vetrificazione.

Quindi ritrarre le pinzette che trattengono la griglia EM nella vetrificatrice. Successivamente, posizionare il contenitore del refrigerante riempito con LN 2 adeguato ed etano liquido nell'apposito supporto della vetrificazione utilizzando l'apposito comando di videata della vetrificazione. Sollevare la camera del refrigerante verso l'alto fino a quando non viene lavata con il fondo della camera di umidità con le pinzette a punta piatta.

Afferrare un bordo della carta da filtro in modo che il lato più corto sia perpendicolare alle pinzette. Questa faccia entrerà in contatto diretto con la griglia EM per il blotting. Ora, inserire con cautela la carta da filtro nel foro laterale della camera di umidità in modo stabile Tenere la carta contro la griglia EM per 10 secondi, scartare la carta e immergersi immediatamente.

Congelare il campione nell'etano liquido utilizzando l'automazione della vetrificazione. Successivamente, trasferire con cura la griglia EM idratata congelata in una delle fessure della griglia di stoccaggio. Questa è un'immagine al microscopio ottico dell'area centrale di una griglia EM a un ingrandimento di 10 volte su cui i neuroni primari di ratto sono cresciuti per due settimane.

Ecco la vista ingrandita dell'aqua box dove si osservano i neuroni e le loro proiezioni di neuriti. Si tratta di una micrografia elettronica di un neurite che si proietta verso l'esterno dal corpo del neurone con un ingrandimento di 4K. Il riquadro blu è visto da vicino qui, dove le caratteristiche interne dei neuriti sono chiaramente visibili con un ingrandimento di 20 K.

Questo video mostra una pila ricostruita in 3D di micrografie di un neurite proveniente dalla coltura primaria di neuroni ippocampali di ratto. Viene riprodotto utilizzando la tomografia e seguito dalla corrispondente annotazione a colori 3D. Ecco un altro video che mostra una pila ricostruita in 3D di immagini di un assone del ganglio della radice dorsale di ratto raccolte utilizzando la tomografia crioelettronica seguita dalla corrispondente annotazione a colori 3D e mostrato qui è il montaggio di quattro immagini crio-EM 2D di un assone separato del ganglio della radice dorsale di ratto prese con un ingrandimento di 20 K.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i neuroni primari su griglie di microscopia elettronica in modo tale da essere adatto per visualizzare i loro neuroni in uno stato idratato congelato utilizzando la tomografia crioelettronica.