Name: Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Impara a preparare neuroni primari di ratto su griglie per microscopia elettronica con vitrificazione per analisi crioelettronica. Questo metodo consente la visualizzazione 3D dell'ultrastruttura dei neuriti in stato idratato congelato.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH (PN2EY016525 e P41GM103832). SHS è stato sostenuto da una borsa di studio dal Nanobiologia Interdisciplinare Graduate Program Formazione del WM Keck Center for Interdisciplinary Bioscience formazione della Costa del Golfo Consorzi (NIH di Grant No. T32EB009379). SHS sezionato, crebbe e vetrificati DRG e cellule dell&#39;ippocampo, raccolte crio-ET dati di DRG e assoni ippocampo Cryo-EM e, ricostruito e colore-annotato la serie tilt. MRG sezionato e fornito cellule dell&#39;ippocampo nel laboratorio di MNR. SC assistito in serie tilt annotazione. SHS è stato addestrato da CW su come sezionare e crescere neuroni. SHS, WCM e WC concepito gli esperimenti. SHS preparato il manoscritto con il contributo di altri autori. Questo video è stato girato presso il Centro di Imaging Cellulare e NanoAnalytics (C-CINA), del Biozentrum di tegli Università di Basilea. C-CINA è integrato nel Dipartimento per Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) del Politecnico federale di Zurigo, che si trova a Basilea, in Svizzera.

1. Preparazione di piatti con EM griglie per la placcatura neuroni primari <ol><li> Esaminare l&#39;integrità di carbonio bucata sulle griglie oro EM utilizzando un microscopio ottico a ingrandimento di almeno 25X. Assicurarsi che i fori di carbonio sono&gt; 98% intatto. </li><li> Per placcatura neuroni primari, utilizzare un becco Bunsen a fiamma sterilizzare le griglie EM e contemporaneamente renderli idrofilo. Utilizzare le pinzette per raccogliere la griglia di EM per il bordo, non è la zona reticolata centrale. ATTENZIONE: Non lasciare mai un becco Bunsen acceso incustodito, e non utilizzare guanti o pinze con componenti in plastica durante l&#39;esecuzione di questi passaggi: <ol><li> Prima di accendere il bruciatore Bunsen, impostare le regolazioni aria e gas in una posizione minimamente aperta. </li><li> Accendere il becco Bunsen con una selce attaccante o butano. </li><li> Modificare le regolazioni aria e gas per ottenere un piccolo, fiamma interiore blu all&#39;interno di un più alto, più leggera fiamma blu / violetto. La punta della fiamma interiore è la parte più calda della fiamma. La manopola sottoneath il bruciatore regola la quantità di gas di penetrare nel tubo del bruciatore, mentre la canna del bruciatore può essere ruotata per regolare la quantità di aria che entra nel bruciatore. Ruotando la regolazione dell&#39;aria in senso orario diminuisce l&#39;aria (risultante in una fiamma viola) e in senso antiorario, l&#39;aria (risultante in una fiamma gialla). </li><li> Con una pinzetta in metallo (senza parti in plastica) per tenere la griglia di EM, passare rapidamente attraverso la fiamma per due volte, di fronte carbonio-side up. Il lato carbonio apparirà più opaco (meno lucida) e con più di una tinta grigio rispetto al lato opposto. </li><li> Trasferire immediatamente la griglia (carbonio-lato alto) nel centro del piatto fondo di vetro collocato entro 10 cm dal becco Bunsen. Utilizzare una griglia di EM per ogni piatto (Figura 1). Utilizzare solo piatti con fondo di vetro che sono presterilized, vale a dire tramite raggi gamma. </li></ol></li><li> Utilizzare un microscopio ottico per controllare l&#39;integrità della rete (buchi di carbonio intatto) pur mantenendo la griglia EM all&#39;interno del vetro-bottpiatto om (per evitare contaminazioni). Quando si applica qualsiasi sostanza sulla griglia o qualsiasi cosa che verrà in contatto con i neuroni, utilizzare procedura sterile e puntali sterili. </li><li> In una cappa di coltura utilizzando la procedura sterile, applicare 250 microlitri della sostanza di rivestimento appropriato lentamente e accuratamente la superficie vetrata centrale della piastra di Petri. Assicurarsi che l&#39;appropriato sostanza di rivestimento copre l&#39;intera griglia EM. <ol><li> Per neuroni ippocampali, utilizzare poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) come sostanza di rivestimento, preparato come descritto in precedenza 19. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza. Per i gangli spinali (DRG) neuroni, utilizzare una miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del sarcoma del mouse (vedi Tabella dei Materiali e reagenti) come sostanza di rivestimento, preparare quanto segue. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza. <ol><li> Scongelare una bottiglia stockdella miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del mouse sarcoma notte a 4 ° C. </li><li> Mantenere freddo miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del sarcoma topo, e tutti i componenti utilizzati per rendere la soluzione, ossia del loro mantenimento sul ghiaccio. </li><li> Mentre su ghiaccio, diluire questa miscela proteica gelatinosa Neurobasal mezzo per ottenere una diluizione 1:20 (cioè attenuare 500 microlitri della miscela proteica gelatinosa in 10 ml di Neurobasal). </li><li> Dividere diluito miscela proteica gelatinosa in aliquote da 1 ml, e memorizzare immediatamente eventuali aliquote supplementari a -20 ° C. </li><li> Applicare 250 microlitri per griglia EM, per ogni piatto, come descritto nella Sezione 1.4. </li></ol></li></ol></li><li> Coprire il piatto Petri con la sua parte superiore e incubare (sia con PLL per campioni ippocampali, OR con miscela proteica gelatinosa per campioni DRG) per 1 ora a temperatura ambiente nella cappa coltura tissutale. </li><li> Aspiclassificare tutti PLL (per campioni di ippocampo) o miscela proteica gelatinosa (per campioni DRG) dai piatti. Per effettuare questa operazione, utilizzare il sistema di aspirazione della cappa coltura tissutale. Utilizzare un puntale sterile attaccato al tubo a vuoto. Evitare il contatto diretto con la rete EM. </li><li> Utilizzare una pipetta a spostamento d&#39;aria regolabile attentamente applicare 250 microlitri di PBS sterile (PBS) alla griglia EM nella zona centrale in vetro di ogni piatto Petri, tale che la griglia EM è completamente coperto da PBS. Poi, aspirare il PBS da ogni piatto. Ripetere 3x. </li><li> Lasciare i piatti con griglie EM ad asciugare sotto il cofano coltura di tessuti per 15 min. Assicurarsi che siano completamente asciutti controllando al microscopio luce nella stanza coltura di tessuti. Assicurarsi che non vi siano bolle di umidità nella griglia. Se è così, attenzione aspirare accanto alla griglia EM per eliminare questa umidità supplementare. La griglia rivestita deve essere usato immediatamente per la placcatura di neuroni. </li></ol> 2. Preparazione e Plrativo Primaria neuroni su EM griglie <ol><li> Per piastra neuroni primari, prima sezionare, trypsinize (con 2,5% tripsina) e triturare dissociare il dell&#39;ippocampo (o dorsale radice gangli di 18 giorni di età embrioni di ratto) nelle singole celle, come descritto in precedenza 19. <ol><li> Triturare è un termine comunemente usato dai neurobiologi per descrivere dissociazione grumi di cellule in singole celle, in particolare mediante l&#39;utilizzo di una pipetta di vetro con una punta sterilizzata. Il risultato si ottiene con attenzione e lentamente disegno e rilasciando le cellule, su e giù, più volte (~ 30) tramite la pipetta. </li></ol></li><li> Seguire le procedure descritte in precedenza per DRG dissezione e isolamento delle cellule 24, prendendo atto di usare 0,25% tripsina (in HBSS) per isolare i neuroni DRG di ratto, invece di utilizzare gli enzimi suggeriti (papaina, collagenasi / dispasi) che sono più adatti per il mouse neuroni DRG. </li><li> Calcolare il numero di neuroni isolati (ad esempio con un emocitometro)e utilizzare questo valore per calcolare il volume appropriato di cellule da applicare a ogni piatto per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule / ml al piatto. Il volume massimo da applicare è di 250 microlitri. Si noti che questo riempie solo la zona centrale in vetro, non l&#39;intera piastra. </li><li> Incubare i piatti per 30 minuti in un incubatore CO 2 a 37 ° C. Consentono alle cellule di recuperare e di aderire. </li><li> Aggiungere lentamente 1,5 ml di mezzi riscaldati ad ogni piatto, facendo attenzione a non disturbare la griglia EM. Il tipo di supporto dipende dal tipo di cellula (dell&#39;ippocampo o DRG). <ol><li> Preparare il supporto appropriato per entrambi neuroni ippocampali 19 o dorsali radice gangliari neuroni 24, che viene riscaldato in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C prima dell&#39;uso. Incubare i piatti pernottamento in CO 2 incubatore. </li><li> Per i neuroni dell&#39;ippocampo, cambiare i media il giorno successivo. Cambiare la metà dei media ogni due giorni in poi per 14 giorni. Riscaldare il supporto in un bagno d&#39;acqua a 37 ° prima dell&#39;uso. </li&gt; <li> Per neuroni DRG, il giorno dopo dissezione / placcatura, preparare un nuovo ceppo di media con un agente anti-mitotico (Uridine e 5&#39;-Fluoro-2&#39;-deossiuridina) ottenere una soluzione stock 10 mM di ciascuno, separatamente, utilizzare una finale concentrazione di 10 mM per ciascuno. Rimuovere la metà dei mezzi di DRG (875 ml) e aggiungere 875 ml di mezzi freschi con l&#39;agente anti-mitotico. <ol><li> Per neuroni DRG, ogni due giorni per la prima settimana, si alternano a cambiare i media tra i media anti-mitotico e media DRG standard. Per la seconda settimana, cambiare i media DRG standard, ogni due giorni. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vitrifying Neuroni su EM griglie <ol><li> Preparare attrezzature e tutto il materiale per il congelamento e la conservazione delle reti oro EM a temperatura criogenica: un dispositivo di vetrificazione con una camera di umidità 17, fine-point pinzette specializzati per la macchina vetrificazione, pinzette point lungo piatta, Dewar (s) di azoto liquido (LN 2), cContenitore oolant, contenitore griglia EM, carta da filtro priva di calcio. </li><li> Avviare il dispositivo di vetrificazione. Impostare l&#39;umidità al 100% e temperatura di 32 ° C. Nella sezione &quot;Console&quot;, impostare il tempo macchia di zero secondi. Questo permette manuale assorbente attraverso il lato-finestra della camera umida della macchina vetrificazione. </li><li> Maneggiare la carta da filtro priva di calcio con i guanti, stratificazione loro tale che tre carte sono impilate. Tagliare la pila a 0,5 centimetri strisce larghe che sono ~ 2 cm di lunghezza. Piegarle a 90 ° in modo tale che un lato della carta ha di 0,5 cm x 0,5 centimetri faccia (Figura 2). Usando le pinzette, rimuovere la carta centrale e metterlo su un altro filtro di carta senza calcio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Mettere il pulsante di memorizzazione griglia nel supporto bottone all&#39;interno della camera di vetrificazione. Riempire la camera interna del contenitore refrigerante con azoto liquido e attendere fino a completa evaporazione. Riempire la camera esterna del secoloe contenitore refrigerante con azoto liquido finché non raggiunge una temperatura stabile per procedere al passo successivo. Riempire la camera interna con elevata purezza etano gassoso che condensano allo stato liquido all&#39;interno della camera raffreddata. </li><li> Spostare il piatto (es) dal termostato a un grande piatto polistirolo 100 mm per il trasporto alla camera vetrificazione, se non nelle immediate vicinanze. Utilizzare le pinzette vetrificazione specializzati per scegliere con cura la griglia EM dal piatto. Si noti che parte i neuroni crescono sulla griglia EM; posizione avrà importanza per il passaggio successivo. Utilizzare il blocco scorrimento nera sulle pinzette per bloccare saldamente le pinzette sulla griglia EM. </li><li> Inserire le pinzette nella macchina vetrificazione tale lato della griglia EM in cui i neuroni sono rispettati volti a fianco, lontano dal foro della macchina vetrificazione apertura laterale. Ritrarre le pinzette specializzati nella macchina vetrificazione. </li><li> Posizionare il contenitore refrigerante nel supporto appropriatodella macchina vetrificazione. Deve essere riempita con un adeguato LN 2 ed etano liquido. Utilizzo del comando schermata appropriata della macchina vetrificazione, sollevare la camera refrigerante verso l&#39;alto fino a quando è lavata con il fondo della camera umida. </li><li> Con le pinzette punta piatta, afferrare un bordo della carta da filtro in modo tale che il lato minore (di 0,5 cm x 0,5 centimetri faccia) è perpendicolare alle pinzette. Questa faccia entrerà in contatto diretto con la griglia EM per blotting (Figura 2B). Inserire delicatamente la carta da filtro nel lato foro della camera di umidità della macchina vetrificazione (Figura 2A). Stabilmente tenere la carta contro la griglia EM (il lato opposto a campione) per 10 sec. Eliminare la carta dopo e subito sprofondare-congelare i campioni in etano liquido utilizzando l&#39;automazione della macchina vetrificazione. </li><li> Trasferire accuratamente la griglia EM frozen-idrato ad uno degli slot in uno deipulsanti di storage di rete. Ripetere la procedura per ulteriori griglie EM nei piatti. I pulsanti di storage di rete EM utilizzati in questi esperimenti possono memorizzare più griglie EM congelati-idratata. </li></ol> 4. Immagine raccolta, elaborazione, e annotazione <ol><li> Procedere per raccogliere microscopio elettronico 2-D e / o 3-D serie tilt 5 dei neuriti utilizzando un microscopio crio-elettroni in condizioni di basse dosi. Le immagini 2-D sono stati destinati a valutare la qualità della rete in termini di spessore del ghiaccio e le possibili aree utili per serie tilt 3-D. <ol><li> In questo caso, tutte le immagini sono stati raccolti usando una camera CCD 4k x 4k attaccato ad un microscopio elettronico a 200 kV equipaggiata con un solo conduttore inclinazione azoto liquido trasferimento criogenico, a 20k microscopio ingrandimento ad un bersaglio underfocus di 7 micron e campionamento di 4,4 Å / pixel. </li><li> Per ottenere una tomografia 3D del campione, prendere una serie di immagini di proiezione, mentre incrementale inclinando il campione along un asse del microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Date le inclinazioni e le altre impostazioni sperimentali, ci sono diversi software differenti disponibili per raccogliere automaticamente le serie tilt 5. La serie tilt 3-D mostrato qui sono stati raccolti sulla stessa microscopio usando semiautomatico software di acquisizione serie inclinazione 26 in un intervallo di -60 ° a 60 ° a 5 ° incrementi con una dose cumulativa di ~ 60 e / a 2. </li></ol></li><li> Ricostruire la serie inclinazione dei neuriti utilizzando un software di elaborazione delle immagini 21 come precedentemente descritto per altri campioni 5,29. </li><li> Colore-annotare le caratteristiche 3-D del neuriti dal primo segmentando il tomogramma e creando un modello di superficie utilizzando una 3-D software di elaborazione di immagini come descritto in precedenza 5. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo dimostrato che i neuroni di ratto embrionali (ganglio della radice dorsale e ippocampo) possono essere coltivate su oro microscopia elettronica (EM) griglie e congelati in ghiaccio vitreo abbastanza sottile per i loro neuriti essere ripreso con 2-D Cryo-EM e 3-D crio- ET. Mentre neuriti dell&#39;ippocampo sono stati precedentemente fotografato con crio-ET 8,10,18,23, un protocollo abbastanza dettagliato per la replica di successo utilizzando dispositivi disponibili in commercio è stata carente. Inoltr...

I neuroni stabiliscono il complesso essenziale circuiteria per la funzione del sistema nervoso centrale e periferico elaborando dendriti ricevere informazioni e assoni, spesso molto lunghe, per comunicare con i neuroni a valle. Crescita dei neuriti gioca un ruolo fondamentale durante lo sviluppo embrionale e la differenziazione e la manutenzione di neuriti neuronale supporta criticamente la funzione del sistema nervoso. Processi neuritic dispongono inoltre criticamente in danno neuronale e rigenerazione, così come disturbi del sistema nervoso. Lo studio di architettura neuronale è fondamentale per capire sia il cervello normale e malato. Fortunatamente, fisiologicamente rilevanti sistemi di coltura di cellule neuronali esistono che possono ricapitolare strutture cellulari complesse ed eterogenee. Sulla base della spiegazione di piattaforme sperimentali solide strategie di visualizzazione efficaci che consentano analisi qualitative e quantitative di morfologia neuronale sono necessari. Particolarmente utile sarebbeuna metodologia dettagliata che fornisce una piattaforma coerente per la visualizzazione neuriti, sia assoni e dendriti in scala nanometrica. Microscopia elettronica tradizionale richiede l&#39;uso di solventi organici durante la disidratazione e l&#39;incorporamento resina, che può indurre distorsioni nei campioni dal loro vero stato. Ad oggi, la maggior parte delle caratterizzazioni strutturali a scala nanometrica sono basati su cellule o tessuti più grandi che sono sottoposti a tali sostanze chimiche aggressive - limitando così l&#39;interpretazione dei risultati 4,9,25. Inoltre, per la penetrazione fascio di elettroni, sezionamento è necessaria per gli organismi o sporgenze cellulari che presentano uno spessore maggiore di 1 micron 12. Infine, sezionato o lavorato risultati tessuto in collezione di insiemi di dati discreti specifico slice, rendendo ingombrante la definizione della funzione allungata di neuriti. Anche per crio-EM, in cui sezionando un campione congelato-idratato è possibile, il metodo introduce artif compressioneatti 1. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno imparato a coltivare i neuroni dell&#39;ippocampo direttamente su griglie EM e-flash congelamento loro in etano liquido per visualizzare successivamente neuriti con crio-ET 8,10,18,23. Tuttavia, tali studi né usano un dispositivo su misura 10,23, oppure dettagli mancanza sul gradino assorbente per la generazione di ghiaccio vitreo abbastanza sottile per la visualizzazione di routine 8,18. Per esempio, uno studio raccomanda l&#39;uso di 30-40 sec per blotting griglia EM 10, tuttavia, questo valore non è ottimizzata per uso generale, ma è specifico per il dispositivo-tuffo congelamento misura. Utilizzando un dispositivo su misura, piuttosto che un disponibile in commercio un 17 per mantenere l&#39;umidità prima di immergersi congelamento del campione potrebbe rappresentare un ostacolo per la diffusa riproducibilità. Anche se questi studi sono stati Innovativo nel visualizzare neuriti da crio-ET, abbiamo compiuto un ulteriore passo avanti per esplorare l&#39;applicability di crio-ET ad una varietà di esemplari neuronali (ippocampo e gangli delle radici dorsali neuroni). Inoltre, si discute sia i risultati ottimali e non ottimali, così come i potenziali artefatti che si potrebbe riscontrare utilizzando crio-ET per tali esemplari. Definizione di una tecnica dettagliata per la conservazione e la visualizzazione di neuriti interi su scala nanometrica in uno stato quasi native aumenterebbe la possibilità per i più ricercatori di effettuare studi ultrastrutturali. A tal fine, si descrive un protocollo efficace e dettagliato utilizzando apparecchiature disponibili in commercio per la preparazione non fissati, i neuroni non colorati per visualizzare neuriti. Questo è un primo importante passo verso dettagliare l&#39;ultrastruttura dei neuriti sani e di gettare le basi per capire quali sono presenti in modelli di malattia del sistema nervoso differenze strutturali. Poiché crio-ET in grado di risolvere non fissate, le caratteristiche dei neuriti non colorati in 3-D su scala nanometrica, il metodo renderà possibile, come mai esserepertanto definire architettura neuritic 12.

<table><tbody><tr><td>Dumont #7 Pinzette</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72803-01</td><td>Per la manipolazione di griglie EM</td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>Per campione in crescita</td></tr><tr><td>Griglie per microscopia elettronica</td><td>Quantifoil</td><td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td><td>Per campione in crescita</td></tr><tr><td>Carta da filtro senza calcio</td><td>Whatman</td><td>1541-055</td><td>Per campione tamponante</td></tr><tr><td>Pinzette lunghe a punta piatta Excelta</td><td>Corporation</td><td>E003-000590, 25-SA</td><td>Per tamponamento del campione&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo di vetrificazione e pinzette</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark III</td><td>Per il congelamento di campioni</td></tr><tr><td>Scatole di stoccaggio Minigrid</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>160-40</td><td>Per la conservazione delle griglie EM</td></tr><tr><td>Supporto per trasferimento criogenico</td><td>Gatan</td><td>626 Supporto per trasferimento criogenico di azoto liquido a inclinazione singola</td><td>Per campioni di imaging Software</td></tr> di <tr><td>acquisizione in serie inclinabile semiautomatico</td><td>SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td> <td>Per campioni di imaging</td></tr><tr><td>Software di elaborazione immagini</td><td>IMOD eTomo</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td> <td>Per l'elaborazione di immagini</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione per cryoEM</td><td>JEOL, Tokyo</td><td>200-kV JEM2100 LaB6 microscopio elettronico</td><td>Per campioni di imaging</td></tr><tr><td>Telecamera CCD 4k x 4k</td><td>Gatan</td><td>N/A</td><td>Per campioni di imaging</td></tr><tr><td>Software di annotazione 3D</td><td>Visage Imaging GmbH</td><td>Amira/Avizo</td><td>Per l'elaborazione di dati 3D</td></tr><tr><td>Software per lo stitching digitale di immagini 2D</td><td>Adobe</td><td>Adobe Photoshop</td><td>Per l'elaborazione di dati 2D</td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td>Per coltura ippocampale</td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-0252</td><td>Per coltura ippocampale</td></tr><tr><td>Tetraborato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-9876</td><td>Per coltura ippocampale</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636-500MG</td><td>Per coltura ippocampale</td></tr><tr><td>Sistema di filtri</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>Per coltura ippocampale</td></tr><tr><td>Terreno neurobasale</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Per coltura DRG</td></tr><tr><td>Integratore B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Per coltura DRG</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Per coltura DRG</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Per coltura DRG</td></tr><tr><td>R& R& ratto ricombinante</td><td> D Systems</td><td>556-NG</td><td>Per coltura DRG</td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma</td><td>U3003-5G</td><td>Per coltura DRG</td></tr><tr><td>5'-Fluoro-2'-deossiuridina</td><td>Sigma</td><td>F0503-100MG</td><td>Per coltura DRG</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Per coltura DRG</td></tr></tbody></table>

preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno stato frozen-idratata utilizzo cryo-electron positron

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neuriti, entrambi i dendriti e degli assoni, sono processi cellulari neuronali che consentono la conduzione degli impulsi elettrici tra i neuroni. Definire la struttura dei neuriti è fondamentale per capire come questi processi si muovono materiali e segnali che supportano la comunicazione sinaptica. La microscopia elettronica (EM) è stato tradizionalmente usato per valutare le caratteristiche ultrastrutturali all&#39;interno neuriti, tuttavia, l&#39;esposizione a solventi organici durante la disidratazione e resina embedding può distorcere strutture. Un importante obiettivo insoddisfatto è la formulazione di procedure che consentano alle valutazioni strutturali non interessate da tali artefatti. Qui, abbiamo stabilito un protocollo dettagliato e riproducibile per la coltivazione e il flash congelamento neuriti interi di diversi neuroni primari di elettroni griglie di microscopia seguita dalla loro esame con crio-elettroni tomografia (crio-ET). Questa tecnica permette di visualizzazione 3-D di surgelati, neuriti idratati a risoluzione nanometrica, facilitando assessment delle loro differenze morfologiche. Il nostro protocollo produce una visione senza precedenti della radice dorsale ganglio (DRG) neuriti, e una visualizzazione dei neuriti dell&#39;ippocampo nel loro stato quasi native. Come tali, questi metodi creano una base per gli studi futuri su neuriti di entrambi i neuroni normali e quelle colpito da disturbi neurologici.

Prima di congelamento e di imaging via crio-ET, immagini al microscopio di luce dovrebbero essere prese della rete EM in cui i neuroni sono in crescita. Neuriti dovrebbero essere chiaramente visibile senza sovrapposizione significativa tra loro. Una casella colorata in Figura 3A rappresenta una zona che è ingrandita per mostrare un ingrandimento maggiore nella Figura 3B, in cui neuriti estendono attraverso la struttura a reticolo della griglia. Ciascuna griglia quadrati è composto da un...

Per conservare processi neuronali per l&#39;analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica.

Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare neuroni primari di ratto in modo che i loro neuroni siano adatti alla visualizzazione mediante microscopia elettronica criogenica. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando piastre con griglie per microscopia elettronica per la semina dei neuroni primari. Il secondo passaggio consiste nel preparare e seminare i neuroni primari sulle griglie per microscopia elettronica.Successivamente, viene eseguita la vitrificazione dei neuroni su griglie per microscopia elettronica. L'ultimo passaggio consiste nella raccolta di immagini mediante microscopia elettronica criogenica, seguita da post-elaborazione e annotazione. In definitiva, la microscopia elettronica criogenica e la tomografia sono utilizzate per mostrare l'ultrastruttura dei neuriti in uno stato congelato e idratato.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che può essere utilizzata per la visualizzazione tridimensionale di neuriti idratati congelati a risoluzione nanometrica, senza l'uso di fissativi chimici. Ciò facilita la valutazione delle caratteristiche morfologiche più vicine allo stato nativo. Iniziare questa procedura esaminando l'integrità del carbonio forato sui griglie EM d'oro.Utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento di almeno 25 volte, verificare che i fori di carbonio siano integri per oltre il 98%. Per la semina di neuroni primari, utilizzare un becco di Bunsen per sterilizzare mediante fiamma le griglie per microscopia elettronica e, contemporaneamente, renderle idrofile. Trasferire immediatamente la griglia con il lato al carbonio rivolto verso l'alto al centro del vetrino.Piatto inferiore, posizionare una griglia EM per ogni piatto e utilizzare esclusivamente piatti con fondo in vetro pre-sterilizzati. Successivamente, utilizzare un microscopio ottico per verificare l'integrità della griglia, mantenendo ancora la griglia EM all'interno del piatto con fondo in vetro in una cappa a flusso laminare; applicare 250 microlitri della sostanza di rivestimento appropriata sulla zona centrale di vetro della piastra di Petri. Lentamente e con attenzione, assicurarsi che la sostanza di rivestimento appropriata ricopra interamente la griglia EM.In seguito, coprire la piastra di Petri con il suo coperchio e incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare tutta la miscela di poliolo e lisina dalle piastre utilizzando una punta di pipetta sterile collegata al tubo sottovuoto nella cappa. Evitare il contatto diretto con la griglia E EM.In seguito, utilizzare una pipetta ad aria spostata regolabile per applicare con attenzione 250 microlitri di PBS sterile al fine di ricoprire completamente la griglia EM nell'area centrale in vetro di ogni piastra di Petri. Quindi aspirare il PBS da ogni piastra. Ripetere la procedura altre tre volte.Lasciare asciugare le piastre con le griglie EM nell'incubatore per colture cellulari per 15 minuti. Controllare al microscopio ottico. Assicurarsi che siano completamente asciutte e che non vi siano bolle di umidità nella griglia.Altrimenti, aspirare con attenzione accanto alla griglia EM per eliminare l'eccesso di umidità; la griglia rivestita deve essere utilizzata immediatamente per la semina dei neuroni. In questa procedura, calcolare il volume appropriato di cellule per ogni piastra al fine di ottenere una concentrazione di 50.000 cellule per millilitro per piastra. La quantità massima da applicare deve essere di 250 microlitri, sufficienti a riempire soltanto l'area centrale di vetro, non l'intera piastra.Successivamente, incubare le piastre per 30 minuti in un incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius per permettere alle cellule di riprendersi e aderire; dopo 30 minuti, aggiungere lentamente 1,5 millilitri di mezzo cellulare temperato in ciascuna piastra, evitando di toccare la griglia EM per i neuroni ippocampali. Cambiare il mezzo il giorno successivo, quindi sostituire metà del mezzo ogni due giorni per 14 giorni. In questa procedura, preparare l'attrezzatura e tutti i materiali necessari per il congelamento e lo stoccaggio delle griglie EM dorate a temperatura criogenica, inclusi un dispositivo di vetrificazione con camera umida, carta filtro priva di calcio, una pinzetta lunga con punta piatta, una pinzetta fine specializzata per la macchina di vetrificazione, un contenitore di azoto liquido, un contenitore refrigerante e la scatola per lo stoccaggio delle griglie EM.Successivamente, accendere il dispositivo di vitrificazione. Impostare l'umidità al 100% e la temperatura a 32 gradi Celsius. Nella sezione opzioni, impostare il tempo di blocco a zero secondi.Questo permette l'essiccamento manuale attraverso il finestrino laterale della camera umidificata. Successivamente, impilare tre carte filtro prive di calcio. Tagliare la pila in strisce larghe 0,5 centimetri e lunghe circa due centimetri; in seguito, piegarle ad angolo retto in modo che una sezione della carta misuri 0,5 centimetri per 0,5 centimetri.Questa sezione verrà utilizzata per il trasferimento del campione. Rimuovere la carta centrale e posizionarla su un'altra carta da filtro priva di calcio fino al momento dell'uso. Successivamente, utilizzare la pinzetta specializzata per vitrificazione per prelevare con cura la griglia di microscopia elettronica dalla piastra.Osservare il lato della griglia EM su cui i neuroni stanno crescendo, poiché questa posizione sarà importante per il passaggio successivo. Utilizzare quindi il fermo scorrevole nero sulle pinzette per bloccare saldamente le pinzette alla griglia EM. Inserire ora le pinzette nella macchina di vitrificazione in modo che il lato della griglia EM su cui i neuroni sono aderenti sia rivolto a sinistra e lontano dal foro circolare situato sul lato della macchina di vitrificazione.Quindi ritrarre le pinzette che tengono la griglia EM nel macchinario di vitrificazione. Successivamente, posizionare il contenitore del refrigerante riempito con una quantità adeguata di azoto liquido (LN₂) ed etano liquido nel supporto appropriato del macchinario di vitrificazione utilizzando il comando schermo adeguato del macchinario stesso. Sollevare la camera del refrigerante verso l'alto fino a quando non sia allineata con la base della camera dell'umidità, usando le pinzette con punta piatta.Afferrare un bordo della carta da filtro in modo che il lato più corto sia perpendicolare alla pinzetta. Questa faccia entrerà in contatto diretto con la griglia per microscopia elettronica (EM) durante l'assorbimento. Inserire quindi con attenzione la carta da filtro nel foro laterale della camera umida, mantenendola stabilmente. Premere la carta contro la griglia EM per 10 secondi, quindi scartarla ed eseguire immediatamente l'immersione.Congelare il campione nell'etano liquido utilizzando l'automazione della macchina di vetrificazione. Successivamente, trasferire con attenzione la griglia per microscopia elettronica idratata congelata in uno degli alloggiamenti del supporto di conservazione delle griglie. Questa è un'immagine al microscopio ottico dell'area centrale di una griglia per microscopia elettronica a 10 ingrandimenti, su cui neuroni primari di ratto sono stati coltivati per due settimane.Di seguito è mostrata l'immagine ingrandita del riquadro azzurro in cui si osservano i neuroni e le loro proiezioni neuritiche. Si tratta di una microfotografia al microscopio elettronico di un neurite che si estende all'esterno dal corpo neuronale, con un ingrandimento di 4K. Il riquadro blu viene visualizzato in un ingrandimento maggiore, in cui le strutture interne del neurite sono chiaramente visibili a un ingrandimento di 20K.Questo video mostra uno stack ricostruito in 3D di micrografie di un neurite proveniente da colture primarie di neuroni ippocampali di ratto. È stato ottenuto mediante tomografia ed è seguito dall'annotazione colorata corrispondente in 3D. Ecco un altro video che mostra uno stack ricostruito in 3D di immagini di un assone del ganglio radicolare dorsale di ratto, raccolto mediante tomografia crioelettronica, seguito dall'annotazione colorata corrispondente in 3D; qui viene mostrato il fotomontaggio di quattro immagini crioelettroniche in 2D di un assone distinto del ganglio radicolare dorsale di ratto, acquisite a un ingrandimento di 20 K.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare neuroni primari su griglie per microscopia elettronica in modo tale da renderli adatti alla visualizzazione dei loro neuroni in stato congelato idratato mediante tomografia crioelettronica.

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Neuroscienze

Fonte: Schönherr, S., et. al. Immunomarcatura combinata optogenetica e replica di frattura da congelamento per esaminare la disposizione specifica dell'input dei recettori del glutammato nell'amigdala di topo. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra l'immunomarcatura di repliche fratturate da congelamento di tessuto cerebrale di topo per la microscopia elettronica. Le repliche fratturate e rivestite vengono digerite per esporre i recettori. Gli anticorpi primari e secondari marcati con oro...

Immunomarcatura delle proteine della membrana neuronale in un campione di tessuto cerebrale di topo con frattura da congelamento

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Qui, forniamo un semplice, a basso costo, e in tempi rapidi protocollo fissiamo chimicamente tessuto cerebrale dei primati con acroleina fissativo, consentendo per la conservazione a lungo termine che è compatibile con pre-embedding immunoistochimica per microscopia elettronica a trasmissione.

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Basato sull'ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati "test" e "controllo", questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.

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L'obiettivo di questo protocollo è quello di dirigere l'adesione e la crescita cellulare verso aree mirate di griglie per la crio-microscopia elettronica. Ciò si ottiene applicando uno strato antivegetativo che viene ablato in modelli specificati dall'utente seguito dalla deposizione di proteine della matrice extracellulare nelle aree modellate prima della semina cellulare.

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La tomografia crio-STEM fornisce un mezzo per visualizzare organelli di cellule intatte senza incorporamento, sezionamento o altre preparazioni invasive. La risoluzione 3D ottenuta è attualmente nell'intervallo di pochi nanometri, con un campo visivo di diversi micrometri e uno spessore accessibile nell'ordine di 1 μm.

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