Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

L'obiettivo generale di questa procedura è il trapianto di cellule satelliti del muscolo scheletrico di neuroni adulti purificati e quiescenti per il trattamento della lesione del muscolo scheletrico. Ciò si ottiene sezionando prima il muscolo scheletrico da topi adulti e digerendo enzimaticamente il muscolo scheletrico, quindi ordinando le cellule satelliti quiescenti mediante separazione magnetica delle sfere. Successivamente, le cellule isolate vengono espanse su piastre di coltura rivestite di collagene e, nella fase finale, le cellule espanse in vitro vengono iniettate nei muscoli scheletrici trattati con cardio toin di topi adulti.

In definitiva, l'attecchimento e il contributo delle cellule satelliti espanse in vitro alla rigenerazione delle fibre muscolari possono essere valutati mediante colorazione xal. Ciao, mi chiamo sushi ura. Sono professore associato presso lo Stem Cell Institute dell'Università del Minnesota.

L'isolamento della cellula satellite cent, che è una popolazione di cellule staminali di massa, è essenziale per la comprensione della biologia delle cellule staminali muscolari e della rigenerazione, nonché del trapianto di cellule staminali per terapie nelle distrofie muscolari come le distrofie muscolari di Duchenne di massa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che il nostro metodo è un metodo di purificazione rapido, economico e affidabile di cellule satelliti quiescenti dal muscolo di dispersione del topo adulto. Le procedure dimostrative saranno eseguite dal Dr.Rio Moto, postdoc di Hashi e da Yoko Asura, scienziato junior nei miei laboratori.

Per isolare le cellule mononucleate dal muscolo scheletrico del topo, iniziare pizzicando e poi tagliando la pelle addominale di ogni topo adulto di età compresa tra tre e otto settimane soppresso. Sbucciare la pelle in direzioni opposte per esporre completamente i tricipiti e il muscolo della zampa posteriore, quindi tagliare lungo le ossa della gamba per rimuovere il tibiale, il gastro quadricipite anteriore e i muscoli scheletrici del tricipite. Trasferire i muscoli in PBS ghiacciato e sterile in una piastra di 10 centimetri e lavare via il sangue.

Quindi trasferire i muscoli su una nuova piastra sterile di sei centimetri. Successivamente, sotto uno stereomicroscopio, rimuovere il tessuto connettivo, i vasi sanguigni, i fasci nervosi e aggiungere tessuto epigenico dai muscoli. Quindi, utilizzando le forbici oftalmologiche, tagliare e tritare il tessuto in una polpa liscia.

Cercando di non lasciare pezzi di grandi dimensioni. Trasferire i muscoli tritati in una provetta da 50 millilitri e digerire il tessuto in cinque millilitri di soluzione di collagenasi a 37 gradi Celsius. Dopo un'ora, utilizzare una siringa dotata di ago calibro 18 per trire più volte l'impasto tissutale.

Per omogeneizzare la miscela, incubare l'omogenato per altri 15 minuti, quindi ripetere la miscela Per dissociare l'impasto in una sospensione a singola cellula, aggiungere fino a 50 millilitri di terreno e mescolare la soluzione cellulare. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron in una nuova provetta falcon da 50 millilitri. Contare le cellule raccolte e quindi centrifugare la sospensione cellulare dopo aver lavato le cellule, risospendere il pellet in 200 microlitri di terreno, quindi trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per colorare e separare le cellule.

Posizionare la provetta da microcentrifuga sul ghiaccio e quindi incubare le cellule con un microlitro ciascuno dei corpi anticorpali elencati. Dopo 30 minuti, lavare due volte le celle in un millilitro di terreno. Quindi risospendere il pellet in 200 microlitri di terreno e incubare le cellule con 10 microlitri di perle magnetiche anti PE su ghiaccio.

Dopo altri 30 minuti, lavare le celle in un millilitro di tampone max due volte e risospendere il pellet in un millilitro di tampone. Quindi posizionare una colonna LD nel magnete e sciacquare la colonna con 1,5 millilitri di tampone max. Erogare la sospensione cellulare sulla colonna, raccogliendo la frazione di flusso negativo PE in un tubo da 1,5 millilitri.

Quindi centrifugare la frazione PE negativa e risospendere il pellet in 100 microlitri di terreno. Ora incubare le cellule in cinque microlitri di perle magnetiche anti-US IgG su ghiaccio, e poi dopo 30 minuti, lavare le cellule in un millilitro di tampone max due volte Resus sospendendo il pellet in 500 microlitri di tampone. Quindi, posizionare una colonna MS sul magnete e risciacquarla con un millilitro di tampone max.

Quindi erogare le cellule sulla colonna, scartando la frazione di flusso alfa sette negativo. Sciacquare la colonna due volte con un millilitro di tampone max, quindi rimuoverla dal magnete. Quindi sciacquare un millilitro di tampone max attraverso la colonna con uno stantuffo per eluire l'integrina marcata magneticamente sette cellule positive in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi, dopo aver centrifugato la sospensione cellulare, risospendere le cellule purificate nel terreno mioblastico. Infine, piastreggiare le cellule su una piastra di sei centimetri rivestita di matrigel contenente cinque millilitri di terreno mioblastico. Per mantenere la coltura cellulare, nutrire le cellule a giorni alterni con mioblasti a crescita media.

Esibiscono una piccola forma rotonda ed esprimono myo D nei loro nuclei. Quando si è pronti per iniziare la fusione cellulare, sciacquare le cellule una volta con PBS e poi provare a metterle in un incubatore al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius. Dopo tre minuti, raccogliere le cellule dissociate nel terreno mioblastico, far girare le cellule resus, sospendendo il pellet nel mezzo mioblasto, e gonfiare le cellule su nuove piastre rivestite di matrigel.

Per differenziare la coltura cellulare, nutrire le cellule a giorni alterni con il terreno di differenziazione. Dopo un giorno, i mioblasti usciranno dal ciclo cellulare e subiranno la differenziazione in miosina a catena pesante o miociti MHC positivi. Dal terzo al quinto giorno, le cellule si fondono tra loro e generano miotubi multinucleati.

24 ore prima del trapianto di mioblasto, radere i peli intorno alla tibia anteriore o al muscolo TA di un topo sedato di due mesi. Quindi utilizzare una siringa da insulina calibro 31 per iniettare 10 micromolari di cardio toin nel muscolo. Il giorno successivo, staccare i mioblasti proliferanti dalle piastre rivestite di matrigel con tripsina come appena dimostrato e far girare le cellule dissociate, risospendere una volta da 10 a un sesto delle cellule in 50 microlitri di terreno.

Quindi caricare le cellule in una siringa da insulina calibro 31 e trapiantare le cellule per via intramuscolare nell'animale ricevente per la rigenerazione muscolare anteriore del trauma cranico. Da una a quattro settimane dopo l'iniezione, prelevare i muscoli TA per l'analisi istologica. Le cellule satelliti quiescenti appena isolate mostrano una piccola forma rotonda e oltre il 90% di queste cellule esprime PAC sette come marcatore definitivo.

I mioblasti espansi ex vivo possono essere utilizzati per esperimenti di iniezione di cellule intramuscolari per l'esame del contributo dei mioblasti alla rigenerazione delle fibre muscolari e all'autorinnovamento delle cellule satelliti. Quando vengono coltivati in terreno di differenziazione, i mioblasti escono dal ciclo cellulare, si fondono tra loro e diventano miotubi multinucleati che esprimono la catena pesante della miosina da pochi giorni a diversi mesi dopo il trapianto. Le cellule derivate dal donatore positivo lato beta galatto, che includono mioblasti proliferanti, cellule satelliti auto-rinnovanti e fibre muscolari di nuova formazione possono essere rilevate nel muscolo cardio toin danneggiato dopo ogni sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle cellule staminali muscolari e dell'origine muscolare per esplorare il trapianto di cellule staminali tetiche per la distrofia muscolare, I'm Fushi. Sono Yoko. Sono Norio.Grazie.

Grazie per aver guardato.