Uso di pHluorin per valutare la dinamica dei recettori di guida axon nella coltura cellulare e nell'embrione del pulcino

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare una variante di GFP sensibile al pH per studiare le dinamiche spazio-temporali del traffico del recettore di guida degli assoni sulla superficie cellulare. Ciò si ottiene marcando prima il recettore di interesse con la sequenza di Florin utilizzando un'appropriata strategia di clonazione. La seconda fase della procedura consiste nel caratterizzare la sensibilità al pH del recettore marcato con Florin trasfettato in vitro.

Il terzo passo consiste nell'elettroporare il costrutto del recettore marcato con Florin in OVO per ottenere l'espressione nel midollo spinale. Il passaggio finale consiste nel sezionare gli embrioni elettroporati allo stadio desiderato. In definitiva, i risultati possono mostrare cambiamenti nel traffico dei recettori sulla superficie cellulare sia nel dominio spaziale che in quello temporale attraverso la microscopia a immunofluorescenza.

Il vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di costrutti proteici GFP tech, è che la sensibilità al pH dei recettori a tre ali per pH consente il rilevamento di cambiamenti spazio-temporali della dinamica del recettore sulla superficie cellulare, sia in vitro che in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave nel campo di guida Axon. Infatti, può aiutare a caratterizzare la regolazione spazio-temporale di una distribuzione della superficie cellulare di un recettore di guida degli assoni, e sappiamo che la disregolazione è fondamentale per impostare la sensibilità di un cono grossolano su una particolare coda.

Questo metodo può fornire informazioni nel campo della guida degli assoni all'interno del modello di embrione della guancia, ma può essere applicato anche ad altri sistemi come le fette di cervello di topo. Mantenere la coltura in combinazione con l'imaging della vita Hanno preparato sette cellule in DMEM al 70-80% di fluenza co e il gene di interesse clonato nel vettore fiorino. Inizia aggiungendo tre microgrammi di DNA a 200 microlitri di cloruro di sodio da 150 millimolari.

Agitare delicatamente il composto e poi farlo girare brevemente. Quindi aggiungere la quantità appropriata di reagente di trasfezione in questo caso, 10 microlitri e vortex. Lasciare immediatamente riposare il composto per 10 minuti.

Aggiungere la temperatura ambiente. Quindi, aggiungi 200 microlitri della miscela completata alle cellule. Agitare delicatamente la piastra e rimetterla nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 48 ore con un cambio di supporto come descritto nel protocollo di testo.

Due giorni dopo, preparare la camera del microscopio. Ora trasferisci le celle nella camera. Collegare una siringa da cinque millilitri in modo che i componenti possano essere aggiunti direttamente mentre la camera viene mantenuta a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Prima di utilizzare il microscopio, assicurarsi che sia bilanciato per evitare derive meccaniche durante la registrazione. Successivamente, apri il software di imaging e seleziona il programma di acquisizione multidimensionale e trova il costo trasfettato sette celle con l'obiettivo 40 x contrassegna ciascuna delle loro posizioni nel software dove configura lo stack Z a una profondità di acquisizione di 15 micron. Tenere presente che la messa a fuoco può cambiare quando si aggiungono supporti alla camera di imaging.

Impostare la fase corretta, l'esposizione al filtro GFP e il tempo di acquisizione corretto per un esperimento con cinque campi di interesse, rendendo l'acquisizione dell'immagine ogni 20 secondi per 10 minuti dovrebbe essere sufficiente. Avviare le acquisizioni e scattare cinque immagini di controllo nel terreno DMEM pH 7.4. Quindi metti in pausa le acquisizioni.

Iniettare 1,25 millilitri di pH 3,5, completare il DMEM per ottenere un pH di 5,5 nel terreno di coltura. Segna l'evento nel software e riprendi l'acquisizione delle immagini per altri cinque punti temporali. Durante questo periodo, la fluorescenza verde dovrebbe gradualmente scomparire.

Quindi metti in pausa le acquisizioni. Iniettare 1,2 millilitri di pH 9,5, completare il DMEM per ottenere un pH 7,4 nel terreno di coltura. Segna questo evento nel software e acquisisci altri cinque punti tempo.

Ora, la fluorescenza verde dovrebbe riapparire sulla membrana plasmatica. I dettagli sulla manipolazione degli ovuli prima dell'elettroporazione e di altre preparazioni sono forniti nel protocollo di testo. Questa sezione inizia con la creazione di una finestra nell'uovo.

Copri la parte superiore dell'uovo con del nastro adesivo dove verrà ricavata la finestra. Quindi, usando le forbici curve, forare il guscio sul suo grande lato smussato. Rimuovere due millilitri di albumina utilizzando un ago collegato a una siringa da cinque millilitri.

Orientare l'ago verticalmente per evitare di danneggiare il sacco di ylk sulla parte superiore dell'uovo. Fai un altro foro usando lo stesso processo. Quindi, dal secondo foro, taglia una finestra abbastanza grande da visualizzare l'embrione ed essere in grado di lavorarci sopra.

A circa due millilitri di PBS sterile, caldo e modificato, questo previene la disidratazione e aumenta l'accessibilità. Ora inietta il DNA e por l'embrione. Innanzitutto, diluire il plasmide in PBS tra 0,5 e due microgrammi per microlitro, ma non in misura maggiore.

Quindi aggiungere il colorante verde veloce a una concentrazione finale dello 0,025%Caricare la miscela di DNA in un capillare per iniettare il DNA utilizzando un iniettore. Se la resistenza del capillare è troppo grande, potrebbe essere difficile iniettare gli embrioni. Se la resistenza è troppo piccola, la dimensione del capillare potrebbe danneggiare l'embrione con la puntura capillare caricata, il sacco vitellino e il tubo neurale sul lato della coccola, inserirsi nel tubo neurale con un angolo poco profondo e riempire il lume dalla coda alla testa con la miscela di DNA.

Quindi, rapidamente, posizionare gli elettrodi di platino da quattro millimetri su entrambi i lati del tubo neurale e elettroporare con impulsi da 50 millisecondi e 31 volt ogni mezzo secondo. Dovrebbero formarsi delle bolle sugli elettrodi. Evita il cuore o i grandi vasi extraembrionali.

Al termine dell'elettroporazione, utilizzare un ago per rimuovere due millilitri di albumina. Quindi sigillare ermeticamente la finestra e il lato smussato con del nastro adesivo. Rimetti le uova a 38,5 gradi Celsius fino a quando non si sviluppano allo stadio desiderato.

Quindi seguire le procedure per l'inclusione e la criosezione fornite nel protocollo del testo, l'uso di Florin fornisce una risoluzione spaziotemporale precisa dello smistamento del recettore transmembrana sulla membrana plasmatica. Per la dimostrazione plex in uno è stato taggato con Fiorino. È un recettore di guida che media il segnale di se Forin tre B.Il costrutto è stato espresso in vitro.

Nella CO sette cellule e l'imaging di cellule vive è stato eseguito a pH fisiologico. Il recettore era per lo più sulla membrana plasmatica, confermando così il rilevamento del solo pool di superficie cellulare del recettore. Dopo l'elettroporazione innovo, si è scoperto che il plesso in uno si distribuisce sulla superficie del cono di crescita all'incrocio della piastra del pavimento.

Nella fase di pre-attraversamento il plesso in uno non è stato rilevato sulla superficie cellulare. Ciò suggerisce che la segnalazione degli assoni SEMA quattro e tre B è limitata alla fase di post-incrocio. Durante il tentativo di questa procedura, va notato che l'uso dell'influenza del pH è adatto principalmente per il monitoraggio della preparazione della vita.

L'uso dell'influenza del pH nei tessuti fissati richiede una particolare cura durante e dopo la fissazione. Poiché la conferma dell'influenza del pH può essere solo temporanea, il pH di tutte le soluzioni deve essere mantenuto al di sopra di sette e l'osservazione deve essere eseguita poco dopo la fissazione dopo il suo sviluppo. Questo metodo apre la strada ai ricercatori nel campo della guida degli assoni e della migrazione cellulare per esplorare la regolazione della distribuzione sulla superficie cellulare di un recettore di guida in diversi modelli animali come il cele contro la drosofila e il topo.