Drosophila Sviluppo e riproduzione

<em>Drosophila</em> Development and Reproduction

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila Development and Reproduction

3.2: Drosophila Maintenance

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12:51 min

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May 10, 2013

Overview

Uno dei tanti motivi che rendono Drosophila un organismo estremamente prezioso è che le basi molecolari, cellulari e genetiche dello sviluppo sono altamente conservate tra le mosche e gli eucarioti superiori come gli esseri umani. Drosophila progredisce attraverso diverse fasi di sviluppo in un processo noto come il ciclo di vita e ogni fase fornisce una piattaforma unica per la ricerca sullo sviluppo. Questo video introduce ogni fase del ciclo di vita della Drosophila e descrive in dettaglio le caratteristiche fisiche e i principali eventi di sviluppo che si verificano durante ogni fase. Successivamente, il video discute la regolazione genetica della formazione del modello, che è importante per stabilire il piano corporeo dell’organismo e specificare singoli tessuti e organi. Inoltre, questo video offre una panoramica della riproduzione di Drosophila e di come utilizzare le caratteristiche riproduttive di Drosophila per impostare un incrocio genetico. Infine, discutiamo esempi di come i principi dello sviluppo e della riproduzione di Drosophila possono essere applicati alla ricerca. Queste applicazioni includono l’interferenza dell’RNA, i saggi comportamentali dei comportamenti di accoppiamento e le tecniche di imaging dal vivo che ci consentono di visualizzare lo sviluppo come un processo dinamico. Nel complesso, questo video evidenzia l’importanza di comprendere lo sviluppo e la riproduzione in Drosophilae come questa conoscenza può essere utilizzata per comprendere lo sviluppo in altri organismi.

Procedure

Drosophila melanogaster, sono ampiamente utilizzati come organismo modello nello sviluppo e nella riproduzione dello studio. Drosophila progredisce attraverso diverse fasi di sviluppo in un processo noto come il ciclo di vita e ogni fase fornisce una piattaforma unica per la ricerca sullo sviluppo. In questo video, presenteremo le basi dello sviluppo e della riproduzione della Drosophila, incluso come impostare una croce genetica e discuteremo di come questa ricerca può essere applicata per comprendere i processi che vanno dalla guarigione delle ferite al comportamento.

Per prima cosa, discutiamo il ciclo di vita di Drosophila. La Drosophila progredisce attraverso 4 fasi principali dello sviluppo: embrione, larva, pupa e adulto.

L’embrione è un uovo fecondato lungo circa 0,5 mm e di forma ovale. Immediatamente dopo la fecondazione, l’embrione subisce una rapida divisione mitotica senza crescita. Il nucleo zigotico subisce nove cicli di divisione nucleare, ma non subisce citochinesi, formando una cellula multi-nucleata chiamata blastoderma sinciziale. Poiché tutti i nuclei nel blastoderma sinciziale condividono un citoplasma comune, le proteine possono diffondersi liberamente, formando gradienti morfogeni, che sono importanti per stabilire il piano corporeo e il modello dei singoli organi e tessuti nella mosca. Dopo la 10a divisione nucleare, i nuclei migrano verso la periferia del blastoderma sinciziale . Dopo il 13 ° round di divisione nucleare, che si verifica circa 3 ore dopo la fecondazione, i 6000 nuclei nel blastoderma sinciziale si individualizzano formando il blastoderma cellulare . Il blastoderma cellulare contiene un monostrato di cellule e viene trasformato in una complessa struttura multistrato, in un processo noto come gastrulazione. Durante la gastrulazione, i cambiamenti di forma cellulare guidano le invaginazioni del monostrato, creando infine gli strati germinali di endoderma, mesoderma ed ectoderma. L’endoderma dà origine all’intestino, il mesoderma dà origine ai muscoli e al cuore e l’ectoderma dà origine all’epidermide e al sistema nervoso centrale. Dopo 24 ore, gli embrioni si schiudono come larve.

Le larve sono bianche con corpi segmentati simili a vermi. Strisciano in giro nel cibo umido mangiando costantemente, portando a una rapida crescita. Le larve progrediscono attraverso tre fasi: la prima instar per 24 ore, la seconda instar per altre 24 ore e la terza instar per 48 ore. La muta avviene tra ogni fase. Quando sono pronte per la pupa, le larve di terza stella lasciano la loro fonte di cibo e si attaccano a una superficie solida, come il lato di una fiala.

Le pupe sono immobili e sono inizialmente morbide e bianche ma alla fine si induriscono e diventano marroni. Per un periodo di quattro giorni, i tessuti larvali degenerano e si formano tessuti adulti. L’eclosione segna la fine dello stadio pupale e le mosche emergono da adulte.

8 ore dopo l’eclosione, gli adulti diventano sessualmente ricettivi e iniziano ad accoppiarsi, ricominciando il ciclo di vita da capo.

Il ciclo di vita completo dura circa 10 giorni a 25 °C, ma può essere influenzato dalla temperatura. Ad esempio, a 18 °C il ciclo di vita è di circa 19 giorni e a 29 °C, il ciclo di vita è di soli 7 giorni.

Durante lo sviluppo, un’attenta regolazione genetica della formazione del modello stabilisce il piano corporeo e specifica i singoli tessuti e organi. È importante sottolineare che la creazione dell’asse anteriore-posteriore definisce l’orientamento dalla testa alla coda dell’organismo ed è regolata da diversi gruppi di geni.

In primo luogo, i geni dell’effetto materno sono forniti nell’ovocita ed ereditati dalla femmina. Sono importanti nel blastoderma sinstiziale per stabilire inizialmente l’anteriore e il posteriore dell’embrione. In particolare, il genebicoide definisce la parte anteriore dell’embrione compresa la testa e il torace, mentre il gene nanos definisce la parte posteriore, compreso l’addome.

In secondo luogo, i geni di segmentazione, che sono regolati dai geni dell’effetto materno, includono i geni gap e i geni regola di coppia. I geni Gap stabiliscono un piano corporeo segmentato lungo l’asse anteriore-posteriore suddividendo ampiamente l’embrione. I geni della regola di coppia sono espressi in un modello a strisce perpendicolare all’asse anteriore-posteriore, dividendo ulteriormente l’embrione in segmenti più piccoli. Quindi i geni di polarità del segmento, come engrailed iniziano a stabilire i destini cellulari all’interno di ciascun segmento.

Infine, i geni omeotici sono responsabili della definizione di particolari strutture anatomiche, come ali e gambe. È interessante notare che l’ordine dei geni sul cromosoma riflette il modo in cui sono espressi lungo l’asse anteriore-posteriore.

La Drosophila è un organismo estremamente fertile che può produrre migliaia di progenie in una vita. Le femmine depongono centinaia di uova al giorno e continuano a fecondare le uova bene dopo l’accoppiamento.

Drosophila sono anche organismi sessualmente dimorfici, il che significa che le femmine sono fenotipicamente distinte dai maschi. In particolare, i maschi sono più piccoli delle femmine e hanno genitali esterni di colore scuro, così come più pigmento nero sui loro addominali inferiori. I maschi hanno anche una macchia di setole sulle zampe anteriori chiamate pettini sessuali usati per attaccarsi alla femmina durante l’accoppiamento. Queste distinte differenze fenotipiche rendono molto facile distinguere i maschi dalle femmine, il che è particolarmente utile quando si imposta un incrocio genetico.

Impostare un incrocio con Drosophila è una tecnica utile per studiare la genetica. Quindi iniziamo!

Il primo passo per impostare una croce è raccogliere femmine vergini del genotipo desiderato, in modo da poter controllare esattamente con quale maschio si accoppia. I Drosophila non sono in grado di accoppiarsi durante le prime 8 ore dopo l’eclosione, quindi la raccolta di adulti molto giovani garantisce la verginità. Per raccogliere le femmine appena chiuse, svuotare la fiala nell’obitorio per sbarazzarsi di tutti gli adulti. Ogni 3-4 ore, controllare la fiala per gli adulti appena chiusi e raccogliere le femmine in una nuova fiala senza maschi fino a quando non sono pronte per l’uso. Le femmine vergini sono identificate dal loro colore del corpo molto chiaro e da una macchia scura sul loro addome, nota come meconio.

Quando sei pronto per iniziare la croce, combina 4-6 maschi con 4-6 femmine vergini dei genotipi desiderati in una fiala di cibo datata e conserva a 25 ° C e 60% di umidità. Dopo 3-4 giorni, le larve saranno presenti e i genitori dovrebbero essere trasferiti in una nuova fiala, impedendo ai genitori di accoppiarsi con la progenie. Dopo circa 10 giorni, emergeranno nuovi figli e i loro fenotipi potranno essere esaminati.

Uno strumento che i ricercatori di Drosophila usano sono i cromosomi balancer che impediscono la ricombinazione genetica e contengono marcatori genetici come le ali ricci, che sono utili per determinare il genotipo corretto di una mosca. Se volevi mosche eterozigoti per due diverse mutazioni, puoi incrociare un ceppo con mutazione #1 sul cromosoma bilanciatore CyO, a un secondo ceppo con mutazione #2 anche bilanciato su CyO. Qualsiasi progenie che emerge senza ali ricci è eterozigote per entrambe le mutazioni.

Un altro strumento comunemente usato nella ricerca sulla Drosophila è il sistema UAS-GAL4, che consente ai ricercatori di esprimere o abbattere un gene in un tessuto specifico. GAL4 è un fattore di trascrizione del lievito che è guidato da un promotore specifico del tessuto e UAS è la sequenza di attivazione a monte, che controlla l’espressione del gene di interesse . Quando si incrocia una mosca con un transgene GAL4 specifico del tessuto a una mosca con un transgene UAS con il gene di interesse direttamente a valle, la proteina GAL4 lega l’UAS e guida l’espressione del gene desiderato. Ad esempio, UAS-GFP incrociato a apterous-GAL4, che è specifico per i dischi alari in pupa, esprime GFP specificamente in quelle cellule.

Ci sono molte applicazioni che possono essere utilizzate per studiare lo sviluppo e la riproduzione di Drosophila. Un’applicazione sono le analisi comportamentali, in particolare il comportamento di corteggiamento. Durante il corteggiamento, il maschio si orienta verso la femmina e la segue mentre la picchietta con le zampe anteriori. Se la femmina è ricettiva, permette al maschio di montarla. Il maschio arriccia l’addome e trasferisce il liquido seminale nella femmina, un processo noto come copulazione. L’analisi di questi comportamenti di corteggiamento in vari mutanti fornisce informazioni sul controllo genetico del comportamento

Lo sviluppo della drosophila è un processo estremamente dinamico che include molti movimenti cellulari e cambiamenti di forma, che possono essere studiati tramite imaging dal vivo. Ad esempio, la chiusura dorsale durante l’embriogenesi è quando una lacuna nell’epitelio viene chiusa in modo simile a una cerniera che coinvolge la coordinazione di molti tipi di cellule. La chiusura dorsale durante lo sviluppo viene spesso utilizzata come modello per studiare la chiusura della ferita, che può avere implicazioni cliniche.

Una terza applicazione utilizzata per comprendere i processi durante lo sviluppo di Drosophila è l’interferenza dell’RNA, che abbatte l’attività dei singoli geni e può essere utilizzata in schermi genetici inversi su larga scala. Ad esempio, il dsRNA può essere iniettato negli embrioni e l’impatto dell’abbattimento del gene sullo sviluppo degli organi, ad esempio, può essere valutato. Qui, l’interferenza dell’RNA ha rivelato un gene importante per la fusione durante lo sviluppo tracheale.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla riproduzione e allo sviluppo di Drosophila melanogaster . In questo video abbiamo recensito: il ciclo di vita di Drosophila, compresi i dettagli su ogni fase di sviluppo. Abbiamo anche imparato come utilizzare le capacità riproduttive di Drosophila per studiare la genetica e impostare una croce. Infine, abbiamo imparato come lo sviluppo e la riproduzione della Drosophila siano utili per comprendere processi complessi come il comportamento, la chiusura delle ferite e lo sviluppo degli organi.

Transcript

Drosophila melanogaster, are widely used as a model organism in the study development and reproduction. Drosophila progress through several developmental stages in a process known as the life cycle and each stage provides a unique platform for developmental research. In this video, we will present the basics of Drosophila development and reproduction, including how to set up a genetic cross and discuss how this research can be applied to understand processes ranging from wound healing to behavior.

First, let’s discuss the Drosophila life cycle. Drosophila progress through 4 main stages of development: embryo, larva, pupa, and adult.

The embryo is a fertilized egg that is about 0.5 mm long and oval shaped. Immediately after fertilization, the embryo undergoes rapid mitotic division without growth. The zygotic nucleus undergoes nine rounds of nuclear division, but does not undergo cytokinesis, forming a multi-nucleate cell called a syncytial blastoderm. Since all the nuclei in the syncytial blastoderm share a common cytoplasm, proteins can diffuse freely, forming morphogen gradients, which are important for establishing the body plan and patterning of individual organs and tissues in the fly. After the 10th nuclear division, the nuclei migrate to the periphery of the syncytial blastoderm . Following the 13th round of nuclear division, which occurs approximately 3 hours after fertilization, the 6000 nuclei in the syncytial blastoderm become individualized forming the cellular blastoderm . The cellular blastoderm contains a monolayer of cells and is transformed into a complex multi-layered structure, in a process known as gastrulation. During gastrulation, cell shape changes drive invaginations of the monolayer, ultimately creating the endoderm, mesoderm, and ectoderm germ layers. The endoderm gives rise to the gut, the mesoderm gives rise to the muscles and heart, and the ectoderm gives rise to the epidermis and central nervous system. After 24 hours, embryos hatch as larvae.

Larvae are white with worm-like segmented bodies. They crawl around in wet food eating constantly, leading to rapid growth. Larvae progress through three stages: the first instar for 24 hours, second instar for another 24 hours, and third instar for 48 hours. Molting occurs between each stage. When ready for pupation, third instar larvae leave their food source and attach to a firm surface, such as the side of a vial.

Pupa are immobile and are initially soft and white but eventually harden and turn brown. Over a period of four days, larval tissues degenerate and adult tissues form. Eclosion marks the end of the pupal stage and the flies emerge as adults.

8 hours after eclosion, the adults become sexually receptive and begin to mate, starting the life cycle all over again.

The complete life cycle takes about 10 days at 25 °C, but it can be affected by temperature. For example, at 18 °C the life cycle is about 19 days and at 29 °C, the life cycle is only 7 days.

Throughout development, careful genetic regulation of pattern formation establishes the body plan and specifies individual tissues and organs. Importantly, the establishment of the anterior-posterior axis defines the head to tail orientation of the organism, and is regulated by several groups of genes.

First, maternal effect genes are supplied in the oocyte and inherited from the female. They are important in the syncytial blastoderm for initially establishing the anterior and posterior of the embryo. In particular, the bicoid gene defines the anterior of the embryo including the head and thorax, while the nanos gene defines the posterior, including the abdomen.

Second, the segmentation genes, which are regulated by maternal effect genes, include the gap genes and pair rule genes. Gap genes establish a segmented body plan along the anterior-posterior axis by broadly subdividing the embryo. Pair rule genes are expressed in a striped pattern perpendicular to anterior-posterior axis, further dividing the embryo into smaller segments. Then the segment polarity genes, such as engrailed begin to establish cell fates within each segment.

Lastly, homeotic genes are responsible for defining particular anatomical structures, such as wings and legs. Interestingly, the order of the genes on the chromosome reflect how they are expressed along the anterior-posterior axis.

Drosophila are extremely fertile organisms that can produce thousands of progeny in a lifetime. Females lay hundreds of eggs per day and continue to fertilize eggs well after mating has occurred.

Drosophila are also sexually dimorphic organisms meaning that the females are phenotypically distinct from males. In particular, males are smaller than females and have darkly colored external genitalia, as well as more black pigment on their lower abdomens. Males also have a patch of bristles on their forelegs called sex combs used to latch onto the female during copulation. These distinct phenotypic differences make it very easy to distinguish males from females, which is particularly useful when setting up a genetic cross.

Setting up a cross with Drosophila is a useful technique for studying genetics. So let’s get started!

The first step to setting up a cross is to collect virgin females of the desired genotype, so that you can control exactly which male with whom she will mate. Drosophila are unable to mate during the first 8 hours after eclosion, so collecting very young adults guarantees virginity. To collect newly eclosed females, clear the vial into the morgue to get rid of all adults. Every 3-4 hours, check the vial for newly eclosed adults, and collect the females in a new vial without any males until ready for use. Virgin females are identified by their very light body color and a dark spot on their abdomen, known as the meconium.

When ready to begin the cross, combine 4-6 males with 4-6 virgin females of your desired genotypes in a dated food vial, and store at 25° C and 60% humidity. After 3-4 days, larvae will be present and the parents should be transferred to a new vial, preventing the parents from mating with the progeny. After approximately 10 days, new offspring will emerge and their phenotypes can be examined.

One tool that Drosophila researchers use are balancer chromosomes that prevent genetic recombination and contain genetic markers such as curly wings, which are useful in determining the correct genotype of a fly. If you wanted flies that are heterozygous for two different mutations, you can cross a stock with mutation #1 over the balancer chromosome CyO, to a second stock with mutation #2 also balanced over CyO. Any progeny that emerge without curly wings are heterozygous for both mutations.

Another commonly used tool in Drosophila research is the UAS-GAL4 system, which allows researchers to express or knockdown a gene in a specific tissue. GAL4 is a yeast transcription factor that is driven by a tissue specific promoter and UAS is the Upstream Activating sequence, which controls the expression of the gene of interest . When you cross a fly with a tissue specific GAL4 transgene to a fly with a UAS transgene with your gene of interest directly downstream, the GAL4 protein binds the UAS and drives expression of your desired gene. For example, UAS-GFP crossed to apterous-GAL4, which is specific for the wing discs in pupa, expresses GFP specifically in those cells.

There are many applications that can be used to study Drosophila development and reproduction. One application is behavioral analyses – specifically courtship behavior. During courtship, the male orients himself towards the female and follows her while tapping her with his forelegs. If the female is receptive, she allows the male to mount her. The male curls his abdomen and transfers seminal fluid into the female, a process known as copulation. The analyses of these behaviors of courtship in various mutants gives insight into the genetic control of behavior

Drosophila development is an extremely dynamic process that includes many cell movements and shape changes, which can be studied via live imaging. For example, dorsal closure during embryogenesis is when a gap in the epithelium is closed in a zipper-like manner involving the coordination of many cell types. Dorsal closure during development is often used as a model to study wound closure, which may have clinical implications.

A third application used to understand processes during Drosophila development is RNA interference, which knocks down the activity of individual genes and can be used in large scale reverse genetic screens. For example, dsRNA can be injected into embryos, and the impact of the gene knockdown on organ development, for example, can be assessed. Here, RNA interference revealed a gene important for fusion during tracheal development.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Drosophila melanogaster reproduction and development . In this video we reviewed: the Drosophila life cycle, including details about each stage of development. We also learned how to use the reproductive capabilities of Drosophila to study genetics and set up a cross. Finally, we learned how Drosophila development and reproduction are useful for understanding complex processes such as behavior, wound closure, and organ development.

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