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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Manutenzione del lievito

Yeast Maintenance

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Yeast Maintenance

3.3: An Introduction to Caenorhabditis elegans

3.13: Yeast Transformation and Cloning

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08:30 min

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April 30, 2023

Overview

La ricerca condotta nel lievito Saccharomyces cerevisiae ha migliorato significativamente la nostra comprensione di importanti fenomoni cellulari come la regolazione del ciclo cellulare, l’invecchiamento e la morte cellulare. I numerosi vantaggi di lavorare con S. cerevisiae includono il fatto che sono poco costosi da coltivare in laboratorio e che molti ceppi pronti all’uso sono ora disponibili in commercio. Tuttavia, una corretta manutenzione di questo organismo è fondamentale per esperimenti di successo.

Questo video fornirà una panoramica su come coltivare e mantenere S. cerevisiae in laboratorio. Vengono spiegati i concetti di base necessari per monitorare la proliferazione di una popolazione di lieviti, come ad esempio come generare una curva di crescita utilizzando uno spettrofotometro. Questo video dimostra anche le tecniche pratiche necessarie per mantenere S. cerevisiae in laboratorio, compresa la preparazione dei media, come iniziare una nuova coltura di cellule di lievito e come conservare quelle colture. Infine, il video mostra alcuni dei modi in cui queste tecniche di manipolazione e manutenzione vengono applicate nella ricerca scientifica.

Procedure

Le importanti scoperte della regolazione del ciclo cellulare, dell’attività della telomerasi e dell’autofagia in Saccharomyces cerevisiae,hanno dimostrato che questa specie di lievito è un prezioso organismo modello per la ricerca. Il lievito è facile da coltivare e i plasmidi e i ceppi di lievito sono disponibili in commercio. Nonostante i requisiti relativamente economici per la coltivazione del lievito, il mantenimento di questo organismo è fondamentale per esperimenti di successo. Questo video ti darà uno sguardo all’interno su come coltivare colture cellulari di lievito e mantenere i ceppi di S. cerevisiae nei laboratori.

In biologia, le curve di crescita rappresentano il cambiamento nella popolazione cellulare in un periodo di tempo. Nel lievito, la curva di crescita viene generata tracciando la densità ottica, o “OD”, della coltura cellulare a 600 nm nell’asse y e il tempo sull’asse x. La densità ottica o “assorbanza” è il rapporto logaritmico tra l’intensità della luce che entra nella sospensione cellulare di lievito e l’intensità che la attraversa. L’OD a una specifica lunghezza d’onda della luce viene misurato utilizzando uno spettrofotometro.

Quando si lavora con il lievito, la curva di crescita del ceppo di lievito deve essere generata effettuando misurazioni OD a diversi intervalli di tempo. La curva di crescita del lievito è divisa in tre fasi principali: ritardo, logaritmica e fase stazionaria. Durante la fase di ritardo, le cellule si acclimatano all’ambiente e crescono di dimensioni ma non si dividono. Nella fase logaritrica, le cellule si dividono attivamente portando così al raddoppio cellulare. Una volta esauriti i nutrienti disponibili, le cellule di lievito entrano in fase stazionaria, dove la divisione cellulare rallenta e la popolazione cellulare rimane costante.

Utilizzando la curva di crescita, il tempo di raddoppio della deformazione può essere calcolato con la seguente equazione: OD1 e OD2 rappresentano le misurazioni della densità ottica e T1 e T2 sono il tempo tra le misurazioni. Il tempo di raddoppio è definito come il tempo necessario affinché una popolazione di celle raddoppi il numero di celle. Calcola tra due valori OD di fase di log, ad esempio tra i valori 0.2 e 0.5 come mostrato qui. Il lievito di tipo selvatico dovrebbe dare un valore di tempo raddoppiato di circa 90 minuti.

Conoscere il tempo di raddoppio è utile poiché ti permetterà di pianificare i tuoi esperimenti di conseguenza durante il giorno.

Ora che abbiamo coperto i dadi e i bulloni della curva di crescita del lievito, passiamo al laboratorio e facciamo alcune mani sulla preparazione per far crescere le cellule di lievito. I componenti principali dei ricchi mezzi di crescita – AKA Yeast food – sono: estratto di lievito, peptone e una fonte di zucchero. L’estratto di lievito contiene contenuti di cellule di lievito, esclusa la parete cellulare, e fornisce aminoacidi, vitamine, carboidrati e altri nutrienti necessari per la crescita. Il peptone è derivato dalla carne animale o dal latte ed è la principale fonte di aminoacidi nei mezzi di lievito. Una fonte di zucchero, in genere glucosio, viene aggiunta in quanto fornisce energia alle cellule in crescita.

Dopo aver sciolto l’estratto di lievito e il peptone in acqua, sterilizzare la miscela utilizzando un’autoclave. Per preparare piastre di lievito, aggiungere l’agar al mezzo liquido e versare la miscela in piastre, permettendole di solidificarsi a temperatura ambiente. Queste piastre possono essere utilizzate quando si striaturano ceppi per far crescere colonie di lievito.

Ora che abbiamo preparato tutti i nostri media, come possiamo far crescere le culture di queste creature da zero? Prima di tutto, assicurati che tutti gli strumenti, le soluzioni e i supporti siano sterili.

Quindi, ottenere un piatto per strisciare le cellule di lievito. No, non quel tipo di striature! La striatura è il processo di diffusione di colture di lievito liquido su piastra di agar utilizzando uno strumento sterile, come vedete qui. Attorno alle “striature” si formeranno singole colonie, che derivano da una singola cellula di lievito, che può essere raccolta, al fine di ottenere una popolazione genetica pura di cellule di lievito. Una volta che le piastre sono striate, invertire la piastra e metterla in un incubatore a 30 °C per 2 o 3 giorni. Questa è la temperatura ottimale per la crescita del lievito.

Una volta che le colonie si sono formate, inoculare le cellule di lievito in un piccolo volume di mezzi di crescita. Inoculare qui significa scegliere una singola colonia e introdurla ai media mescolandola brevemente. Incubare la coltura in uno shaker o rotatore a 30 °C per 48 ore.

Per far crescere colture più grandi di cellule, controlla prima l’OD600 della coltura di lievito di 2 giorni usando uno spettrofotometro. Effettuare le diluizioni appropriate in modo che l’OD iniziale sia approssimativamente 0,1-0,2. Dopo aver diluito le cellule, posizionare il matraccio in uno shaker a 30 °C e far crescere le cellule fino all’OD desiderato.

La prossima lezione importante dopo aver imparato a coltivare S. cerevisiae è come conservarli per un uso futuro. Il lievito coltivato su piatti può essere conservato a 4 °C fino a 3 mesi. Tuttavia, se si desidera coltivare una coltura fresca, assicurarsi di ri-strisciare le cellule su un piatto fresco prima di inoculare.

Per conservare le scorte di ceppi di lievito per lunghi periodi, aliquotare le cellule in crioviali contenenti glicerolo. Le cellule possono quindi essere conservate a -80 °C, dove possono rimanere fino a diversi anni.

Ora che sei un professionista quando si tratta di coltivare cellule di lievito, diamo un’occhiata a come possiamo applicare queste tecniche essenziali nella ricerca scientifica. Le cellule in fase stazionaria possono essere utilizzate per studiare i geni che regolano l’instabilità del DNA del genoma durante l’invecchiamento. Questo video clip mostra la raccolta di cellule da una cultura di tre giorni. Sono placcati su mezzi selettivi che impediscono alle normali cellule di lievito di crescere. Solo le cellule che hanno acquisito una mutazione possono formare colonie su queste placche. Il numero di colonie sulle placche è proporzionale al livello di instabilità genomica nella coltura.

Un altro esempio di studio dell’invecchiamento è l’analisi della durata cronologica della vita delle cellule di lievito. L’invecchiamento cronologico denota la perdita di vitalità cellulare per un periodo di tempo e può essere studiato coltivando colture liquide come mostrato qui. In questo video, lo scienziato sta caricando varie colture sulle specifiche al fine di generare curve di crescita, che aiuteranno a determinare la vitalità cellulare.

Le cellule di lievito selvatiche in fase di log rappresentano cellule sane e normali e possono essere utilizzate per studiare gli organelli eucariotici, come il ribosoma. In questo video, puoi vedere il caricamento del lisiato cellulare dalle cellule raccolte in fase di log a un gradiente di saccarosio. Successivamente, le cellule vengono filate per sedimentare i ribosomi e viene utilizzato un monitor di assorbanza per generare il profilo ribosomi.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE all’allevamento e al mantenimento di Saccharomyces cerevisiae. In questo video abbiamo esaminato la curva di crescita del lievito, dimostrato come coltivare colture cellulari e mostrato come mantenere i ceppi di lievito. Grazie per aver guardato e non dimenticare di raccomandare questo video a un bocciolo.

Transcript

The important discoveries of cell cycle regulation, telomerase activity, and autophagy in Saccharomyces cerevisiae, have proven that this yeast species a valuable model organism for research. Yeast are easy to grow and yeast plasmids and strains are commercially available. Despite the relatively inexpensive requirements for culturing yeast, maintenance of this organism is critical for successful experiments. This video will give you an inside look in how to grow yeast cell cultures and maintain S. cerevisiae strains in laboratories.

In biology, growth curves represent the change in cell population over a period of time. In yeast, the growth curve is generated by plotting the optical density, or “OD”, of cell culture at 600 nm in the y axis and time on the x axis. Optical density or “absorbance” is the logarithmic ratio of the intensity of light entering the yeast cell suspension to the intensity passing through it. The OD at a specific wavelength of light is measured using a spectrophotometer.

When working with yeast, the growth curve of the yeast strain has to be generated by taking OD measurements at different time intervals. The yeast growth curve is divided into three major phases: lag, logarithmic, and stationary phase. During lag phase, cells are acclimating to the environment and are growing in size but are not dividing. In log phase, cells are actively dividing thus leading to cell doubling. Once available nutrients are depleted, yeast cells enter stationary phase, where cell division slows down and the cell population remains constant.

Using the growth curve, the doubling time of the strain can be calculated with the following equation: OD1 and OD2 represent optical density measurements, and T1 and T2 are the time between measurements. The doubling time is defined as the time required for a cell population to double in cell number. Calculate between two log phase OD values, for example, between values 0.2 and 0.5 as shown here. Wild type yeast should give a doubling time value of approximately 90 minutes.

Knowing the doubling time is beneficial since it will allow you to plan your experiments accordingly throughout the day.

Now that we have covered the nuts and bolts of the yeast growth curve, let’s progress onto the laboratory and do some hands on preparation to grow yeast cells. The major components of rich growth media — AKA Yeast food – are: yeast extract, peptone, and a sugar source. Yeast extract contains yeast cell contents, excluding the cell wall, and provides amino acids, vitamins, carbohydrates, and other nutrients required for growth. Peptone is derived from animal meat or milk and is the main source of amino acids in yeast media. A sugar source, typically glucose, is added as it provides energy to the growing cells.

After dissolving yeast extract and peptone in water, sterilize the mixture using an autoclave. To make yeast media plates, add agar to the liquid media, and pour the mixture into plates, allowing it to solidify at room temperature. These plates can be used when streaking strains to grow yeast colonies.

Now that we have all our media prepared, how do we grow cultures of these critters from scratch? First and foremost, make sure all instrument, solutions, and media are sterile.

Next, obtain a plate to streak out yeast cells. No not that kind of streaking! Streaking is the process of spreading liquid yeast cultures onto agar plate using a sterile instrument, like you see here. Around the “streaks” individual colonies will form, which are derived from a single yeast cell, that can be picked, in order to obtain a pure genetic population of yeast cells. Once plates are streaked, invert the plate and place it in a 30 °C incubator for 2 to 3 days. This is the optimal temperature for yeast growth.

Once colonies have formed, inoculate the yeast cells in a small volume of growth media. Inoculate here means picking a single colony and introducing it to the media by mixing it briefly. Incubate the culture in a 30 °C shaker or rotator for 48 hours.

To grow larger cultures of cells, first check the OD600 of the 2 day-old yeast culture using a spectrophotometer. Make the appropriate dilutions so that the starting OD is approximately 0.1-0.2. After diluting the cells, place the flask in a 30 °C shaker and grow the cells up to the desired OD.

The next important lesson after learning how to grow S. cerevisiae is how to store them for future use. Yeast grown on plates can be stored at 4 °C up to 3 months. However, if you want to grow a fresh culture, make sure you re-streak the cells on a fresh plate first before inoculating.

To store stocks of yeast strains for long periods, aliquot the cells in cryovials containing glycerol. Cells can then be stored at -80 °C, where they can remain up to several years.

Now that you’re a pro when it comes to growing yeast cells, let’s take a look at how we can apply these essential techniques in scientific research. Cells in the stationary phase can be used to study genes that regulate genome DNA instability during aging. This video clip shows the collection of cells from a three-day-old culture. They are plated on selective media that prevents normal yeast cells from growing. Only cells that have acquired a mutation can form colonies on these plates. The number of colonies on the plates is proportional to the level of genomic instability in the culture.

Another example of studying aging is by analyzing the chronological life span of yeast cells. Chronological aging denotes loss of cell viability over a period of time and can be studied by growing liquid cultures as shown here. In this video, the scientist is loading various cultures onto the spec in order to generate growth curves, which will help to determine cell viability.

Wild type yeast cells in log phase represent healthy, normal cells and can be used to study eukaryotic organelles, such as the ribosome. In this video, you can see the loading of the cell lysate from cells collected in log phase to a sucrose gradient. Next, cells are spun to sediment ribosomes and an absorbance monitor is used to generate the ribosome profile.

You’ve just watched JoVE’s introduction to husbandry and maintenance of Saccharomyces cerevisiae. In this video we reviewed the yeast growth curve, demonstrated how to grow cell cultures, and showed you how to maintain yeast strains. Thanks for watching, and don’t forget to recommend this video to a bud.

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