High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli antivirali ad ampio spettro da librerie chimiche utilizzando una combinazione di saggi in vitro basati su cellule. Ciò si ottiene selezionando prima composti che inibiscono la replicazione in vitro di un ceppo ricombinante di virus del morbillo che codifica i luciferi come reporter. Parallelamente, la tossicità del composto viene stimata utilizzando un saggio di vitalità basato sulla luciferasi.

I dati fenotipici combinati di entrambi i saggi vengono utilizzati per isolare le molecole HIIT. I passaggi finali consistono nel ritestare i composti HIIT per la replicazione dose-risposta, l'inibizione del morbillo e del virus della guna di pollo e la misurazione della tossicità in vitro in modo più accurato. In definitiva, i composti antivirali ad ampio spettro vengono identificati e convalidati dallo screening.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi standard di replicazione virale basati sugli effetti citopatici, è che utilizza la luminescenza come lettura e si combina con virus altamente divergenti che esprimono luciferasi come reporter. A dimostrare la procedura saranno Olivier Ellan, un tecnico del team di El Niemans, e Marianne Luca Ori, un ingegnere che lavora con me nell'unità di ricerca di Fredrik JI Begin by warming to room temperature. Le piastre madri a 96 pozzetti contenenti 10 soluzioni madre millimolari di composti chimici in DMSO.

Trasferire cinque microlitri di ciascun composto in nuove piastre da 96 pozzetti già con 20 microlitri di DMSO in ciascun pozzetto, creando così piastre di diluizione intermedie. Ora versa un microlitro di queste piastre di diluizione in pozzetti asciutti di coltura di tessuti con codice a barre bianco. Piastre a 96 pozzetti.

Queste sono le piastre D one e vengono utilizzate per valutare la tossicità di composti a 20 micromolari. Conservali a meno 20 gradi Celsius. Ora crea nuove piastre dalle piastre di diluizione intermedie che vengono ulteriormente diluite 10 volte.

Prelevare quattro microlitri di ciascun composto diluito e mescolarli in pozzetti con 36 microlitri di DMSO. Da queste piastre, trasferire un microlitro per campione in pozzetti asciutti di coltura tissutale bianca con codice a barre a fondo piatto. Piastre a 96 pozzetti.

Queste sono le due piastre D e vengono utilizzate per valutare l'inibizione della replicazione di MV. Conservali anche a meno 20 gradi Celsius. Coltivare 2 cellule T HEK 93 in DMM integrato con L-glutammina stabilizzata ogni quattro o cinque giorni, passare le cellule con la tripsina e fare una decima diluizione in fiasche fresche.

Durante la fase di crescita logaritmica, raccogliere e contare le cellule per l'esperimento. Risospendere le cellule a 300.000 cellule per millilitro. A questa diluizione sono necessari 12,5 millilitri di cellule per ogni piastra che verrà vagliata.

Ora, prepara le piastre con una serie di pozzetti di controllo con un microlitro di DMSO. Addizionare una seconda serie di pozzetti di controllo con un microlitro di DMSO e 2,5 microlitri di una soluzione ipol allo 0,5% per uccidere le cellule. Trasferire la sospensione cellulare in un trogolo ed erogare 100 microlitri in ciascun pozzetto delle piastre D one.

Agitare regolarmente la sospensione per evitare la sedimentazione. Quindi incubare le piastre preparate per 24 ore. Prepara le celle per le piastre come fatto nella sezione precedente.

Il terreno di coltura può essere integrato con uridina per filtrare le molecole antivirali che mirano alle prime fasi della biosintesi delle pirimidine, poiché queste sono abbastanza comuni. Conservare un decimo della sospensione cellulare per i pozzetti di controllo con cellule non infette e infettare il volume rimanente. Scongelare abbastanza.

RMV due lussuose soluzioni stock per infettare la coltura con 0,1 particelle infettive per cellula bersaglio per una molteplicità di infezione di 0,1. Aggiungere il volume calcolato di virus alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente. Trasferire le cellule infette in una mangiatoia e distribuire 100 microlitri di cellule infette nelle due piastre D.

Colonne target da due a 11, che contengono i composti chimici addizionati e pozzetti di controllo positivo nelle colonne uno e 12.Regolarmente. Mescolare delicatamente le cellule nella mangiatoia in file alternate di colonne uno e 12, erogare 100 microlitri di cellule non infette. Ora incubare le piastre per 24 ore.

Trascorso il tempo di incubazione, determinare la vitalità delle cellule D one plate. Mescolare 50 microlitri di reagente di vitalità a base di luciferasi in ciascun pozzetto e attendere 10 minuti. Quindi leggere le lastre con un luminometro.

Impostare il tempo di integrazione su 100 millisecondi per pozzetto. Successivamente, determinare la replicazione MV nelle due piastre D mescolando 50 microlitri di substrato Lucifer Lucciola in ciascun pozzetto e attendendo sei minuti a temperatura ambiente. Consultare quindi un fattore Z per ciascuna piastra D uno e D due del test di tossicità.

Continuare calcolando l'inibizione della replicazione virale. I composti Hi sono quelli che riducono la replicazione virale al di sotto del valore di cutoff applicato e non sono tossici per ogni composto HI. Effettuare diluizioni seriali in DMSO, partendo da 500 micro molari e scendendo a quattro micro molari lungo una colonna di una piastra a 96 pozzetti, aggiungere un microlitro dalla piastra di diluizione del composto alla piastra di coltura tissutale con codice a barre bianco.

Ripetere questo processo due volte per creare un set triplicato di piastre di prova. Quindi riempire le piastre di coltura tissutale con 50 microlitri di terreno di coltura. Ora prepara 37,5 millilitri di cellule T HEK 2 93, sospese in DM EM integrato a 600.000 cellule per millilitro.

Caricare due provette da 15 millilitri con 12,5 millilitri di sospensione cellulare. Ciascuno infetta un tubo di cellule con RMV due Luke con una molteplicità di infezione di 0,1. Infettare il secondo tubo di cellule con chivee ricombinante che esprime luciferi di vaniglia.

Utilizzare una molteplicità di infezioni di 0,2. Mescolare entrambe le provette di cellule infette da virus usando l'inversione. Questo dovrebbe essere eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza tre a causa della patogenicità del chivee che ora carica le cellule non infette e i set di cellule infette nel proprio set di piastre composte HIIT.

Erogare 50 microlitri di cellule per pozzetto e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, aggiungere 50 microlitri di luciferasi lucciola a ciascun pozzetto di due cellule infette da RMV Luke. Allo stesso modo, aggiungere 50 microlitri di substrato di Lucifero alla vaniglia ran alle cellule infette da Chick V Ren alle cellule di controllo non infette aggiungere 50 microlitri di vitalità di base crocifera.

Il reagente procede determinando le concentrazioni di composti hi che inibiscono la replicazione di MV e Chick V del 50%Inoltre, ignorare i composti che mostrano tossicità cellulare. Questa pipeline di screening si basa sulla selezione di composti che non mostrano alcuna tossicità cellulare significativa e inibiscono la replicazione di MV e Chick V come determinato rispettivamente negli screening primari e secondari, sfrutta i virus ricombinanti che esprimono luciferi di lucciola o vaniglia. Come reporter.

La tossicità dei composti viene valutata utilizzando un saggio commerciale basato su luciferi in cui la luminescenza è correlata alle cellule viventi su questa piastra. 21 composti sono stati classificati come tossici in base a una soglia stabilita dai pozzetti di controllo positivo. L'attività antivirale è stata misurata per la prima volta utilizzando RMV due.

Luke Luminescence è stato confrontato con il limite fissato dai pozzetti di controllo. Qui, sono stati trovati quattro composti in grado di inibire la replicazione virale di oltre il 75% nell'altro test. Due di questi sono risultati tossici per tutti i composti HIIT.

La concentrazione inibitoria semimassima è stata determinata sia sui virus MV che su quelli Chick VRNA che esprimono luciferasi. Questi due virus non sono correlati e quindi rendono lo schermo più robusto. Parallelamente, la mancanza di tossicità cellulare di composti selezionati è stata confermata in un esperimento dose-risposta.

In tutto, sono stati identificati 13 composti non tossici da una libreria chimica di 10.000 molecole. Questi composti erano nuovi sia in termini di struttura chimica che di attività biologica. Sulla base delle somiglianze strutturali, i composti si dividevano in tre famiglie chimiche.

Per riferimento, sono stati ottenuti valori di concentrazione inibitoria metà massimali con una sostanza con potente attività antivirale. Osservando questi valori, meno di un ordine di grandezza, separava la molecola di riferimento dalla maggior parte dei colpi attivi identificati attraverso lo schermo. Ciò dimostra l'attività antivirale relativamente forte dei composti selezionati Una volta padroneggiati.

Questa tecnica può essere utilizzata per lo screening di grandi librerie chimiche in un contesto ad alta produttività e per selezionare set di piccole molecole e raggiungere antivirali ad ampio spettro.