Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e In vitro Cardiaca Ipertrofia

[Narratore] L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre una preparazione coerente per la coltura di cardiomiociti funzionali di topo adulto. Per prima cosa rimuovere il cuore del topo in anestesia e incannulamento. Perfondere il cuore e digerire con la collagenasi. Quindi dissociare le cellule e reintrodurre il calcio. Successivamente, semina le cellule e coltiva i cardiomiociti primari. I risultati dei saggi di western blot e di incorporazione della leucina triziata possono dimostrare funzioni quali l'attivazione della fosforilazione di AKT PI3-chinasi-dipendente e l'aumento del tasso di sintesi proteica indotto dall'ouabaina.

- Dopo l'isolamento del cuore, apri rapidamente l'aorta da molti altri vasi, quindi maneggia l'aorta con molta attenzione e agganciala rapidamente al primo tentativo. Con la pratica sarai in grado di determinare quando fermare la digestione della collagenasi del cuore monitorando accuratamente il cambiamento di colore e morbidezza.

- A dimostrare la procedura sarà il dottor Daxiang Li, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio.

- [Narratore] Poco prima della perfusione, prepara un tampone per la digestione fresco contenente collagenasi di tipo II e riscalda il tampone a 37 gradi Celsius quando sei pronto per l'isolamento. Immergere le forbici e le pinze in etanolo al 70% e metterle ad asciugare. Ora pesa il mouse con l'approssimazione di un decimo di grammo. Registra il suo peso corporeo, il ceppo, il sesso e la data di nascita. Iniettare 200 microlitri di eparina per via intraperitoneale per prevenire la coagulazione del sangue nelle arterie coronarie. Dopo 10 minuti, anestetizzare il topo. Dopo cinque-10 minuti, controlla che il mouse non risponda a un pizzicamento della coda o delle dita, quindi fissa il mouse in posizione supina fissando delicatamente le zampe anteriori e posteriori a una superficie di lavoro. Pulire il torace e l'addome con etanolo al 70%, quindi praticare un'incisione cutanea sulla linea mediana dalla metà dell'addome al diaframma. Tenere lo sterno e tagliare bilateralmente. Quindi, tagliare il diaframma e retrofettare la gabbia toracica per esporre il cuore. Ora solleva leggermente il cuore e seziona il cuore fuori dalla cavità toracica il più vicino possibile alla parete toracica dorsale. Trasferire il cuore in un tampone a profusione freddo in un piatto da 100 millimetri. Tagliare con cura i tessuti connettivi come polmoni, timo, bronchi ed esofago. Ora identifica l'aorta e i suoi rami cranici che sono nascosti dal timo e dal cuscinetto adiposo. Taglia l'aorta sotto il suo primo ramo, afferra la parete aortica e solleva il cuore. Controllare che il liquido di profusione goccioli, quindi far scivolare leggermente il cuore sulla cannula aortica piena di liquido di perfusione mantenendo la punta della cannula appena sopra la valvola aortica. Fissare l'aorta alla cannula e legare l'aorta alla cannula con seta chirurgica 6-0. Perfondere il cuore con un tampone di profusione privo di calcio a una velocità di flusso di quattro millilitri al minuto per circa quattro o cinque minuti fino a quando gli effluenti diventano limpidi, quindi passare al tampone di digestione contenente 50 micromolari di cloruro di calcio. Se applicabile, aumentare la pressione post-carico a 70-80 millimetri di mercurio durante la digestione. Quando il cuore diventa leggermente pallido e flaccido, controlla che sia spugnoso quando viene pizzicato delicatamente, quindi interrompi la digestione. Con una pinza imbevuta di etanolo al 70%, estrarre l'aorta dalla cannula e mettere il cuore in un piatto sterile da 60 millimetri contenente 2,5 millilitri di tampone digestivo. Ora spostatevi nella cappa di coltura cellulare e utilizzate forniture sterili e tecniche sterili. Rimuovere l'aorta, gli atri e i grandi vasi con le forbici chirurgiche sottili. Quindi stuzzicare delicatamente il ventricolo in 10-12 piccoli pezzi. Con una pipetta di trasferimento da 10 millilitri, pipettare delicatamente i pezzi di cuore e le cellule e trasferire il campione in una provetta conica in polipropilene da 15 millilitri. Sciacquare la pirofila con 7,5 millilitri di soluzione di calcio I e trasferire il lavaggio nel tubo conico, ottenendo un volume finale di 10 millilitri. Quindi, disperdere i grandi pezzi di tessuto cardiaco pipettandoli delicatamente con una pipetta per il trasferimento dei puntali fini. Quindi centrifugare per tre minuti a 20 G per separare le piccole cellule non miocitarie come le cellule endoteliali e i fibroblasti. Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet di miociti in 10 millilitri di soluzione di calcio che ho integrato con ATP ed equilibrare per tre-cinque minuti. Quindi trasferire aliquote duplicate da 10 microlitri in un emocitometro. Conta i miociti a forma di bastoncino e quelli rotondi, quindi calcola il numero totale di miociti e determina la percentuale di miociti a forma di bastoncello. Pellettare i miociti mediante centrifugazione. Rimuovere i surnatanti e lavare il pellet successivamente in 10 millilitri di concentrazioni crescenti di calcio. Per la coltura primaria di miociti di topo, risospendere il pellet finale di miociti in cinque millilitri di terreno di placcatura per ottenere cardiomiociti tolleranti al calcio. Conta il numero totale di miociti e calcola la percentuale di ciociti a forma di bastoncello. Regolare la concentrazione di miociti a forma di bastoncello a 25.000 miociti a forma di bastoncino per millilitro. Pipettare delicatamente i miociti per garantire la stessa densità cellulare per ogni piatto o piastra. Dopo aver aspirato la soluzione di rivestimento in lamina dalle piastre di coltura, seminare i cardiomiociti e disperdere uniformemente le cellule facendo scorrere delicatamente le piastre in avanti e indietro e da un lato all'altro in uno schema a croce sulla superficie della cappa di coltura. Posizionare le colture in un incubatore di anidride carbonica al 2% a 37 gradi Celsius per consentire l'adesione dei miociti a una velocità di circa l'80%. Ora aspirare delicatamente il terreno contenente miociti non attaccati e detriti cellulari. Rifornisci il terreno di coltura puntando ai lati dei piatti un piatto alla volta. Riportare immediatamente le cellule nell'incubatore di coltura. In una preparazione di successo, i miociti isolati hanno normalmente una forma a rode distinta con estremità rettangolari e striature trasversali chiare. Come test funzionale, sei miociti di topo nero adulto C57 sono stati coltivati e trattati con Ouabaina ed ET1. Questi dati mostrano che l'ouabaina e l'ET1 possono aumentare la fosforilazione di AKT in modo dose-dipendente e anche indurre l'incorporazione di leucina triziata durante la sintesi proteica. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie cardiache per esplorare il meccanismo di regolazione cardiaca nei topi geneticamente modificati.