Pinzetta magnetici per la misurazione di Twist and Torque

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di misurare direttamente le deformazioni torsionali o i cambiamenti nella torsione delle molecole di DNA a doppio filamento a livello di singola molecola. Ciò si ottiene utilizzando due saggi nel primo saggio, chiamati pinzette magnetiche a orbita libera o thumped. Una singola molecola di DNA funzionalizzata è legata tra una perlina magnetica e una superficie di vetro.

Mentre un magnete di forma cilindrica esercita una forza che allunga il DNA In questa configurazione, la posizione angolare delle perle è limitata solo dal DNA legato, non dal magnete, consentendo la rotazione della perlina come mostrato dalla freccia rossa per segnalare i cambiamenti nella torsione delle fluttuazioni termiche rotazionali del DNA della causa. La sua posizione XY per giacere su un anello circolare o ciambella. La conversione di questa posizione XY in angolo di rotazione consente di monitorare i cambiamenti nella torsione del DNA legato in un secondo test correlato chiamato pinzetta a coppia magnetica, o il magnete laterale MTTA viene aggiunto al magnete cilindrico principale per vincolare il movimento angolare delle perline.

Con questa configurazione del magnete, le coppie esterne possono essere applicate alla molecola di DNA legata attraverso la semplice rotazione del gruppo magnetico, la misurazione della deviazione della posizione angolare delle perle dopo aver applicato un numero di giri rispetto alla sua configurazione torsionalmente rilassata iniziale, insieme alla calibrazione della rigidità della trappola magnetica che confina le perle, il movimento angolare consente di quantificare l'accumulo di coppia nel DNA. Il vantaggio principale dell'utilizzo di font e MTT rispetto alle pinzette magnetiche convenzionali è che possiamo misurare direttamente la coppia e le variazioni nella torsione degli acidi nucleici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla meccanica del DNA e dell'RNA, permettendoci di mappare le loro risposte alle forze e alle coppie esterne.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'indagine delle interazioni del DNA con le proteine. Ad esempio, le proteine responsabili della riparazione del DNA, dell'immagazzinamento o della trascrizione La dimostrazione visiva di questo metodo illustra la facilità con cui una pinzetta magnetica convenzionale può essere modificata per dargli nuove capacità. La configurazione utilizzata per i seguenti esperimenti si basa su una configurazione convenzionale di pinzette magnetiche.

Al centro c'è una cella di flusso illuminata dall'alto da un LED e ripresa attraverso un obiettivo per microscopio e una telecamera CCD dal basso. Sopra la cella di flusso c'è una testa magnetica che può essere spostata su e giù e ruotata utilizzando motori controllati da computer. Le immagini della telecamera CCD vengono analizzate in tempo reale da un software di visualizzazione di laboratorio personalizzato per determinare la posizione X, Y e Z delle perle di DNA legate.

Il software di visualizzazione del laboratorio personalizzato è disponibile presso gli autori su richiesta. Dopo aver preparato una cella a flusso con perle magnetiche legate al DNA, montarla sulle pinzette magnetiche convenzionali e selezionare sia una superficie immobilizzata per fare riferimento alla perlina che una perlina a cui è legata una singola molecola di DNA della lunghezza corretta. L'impostazione può essere convertita nella modalità carattere.

Inizia svitando manualmente l'intera testa del magnete che tiene il magnete per la configurazione delle pinzette convenzionali. Sostituiscilo con la testa del magnete che contiene un magnete cilindrico per il carattere. Mentre posizioni il magnete cilindrico utilizzato per F nella testa del magnete, assicurati di mantenere il cavo del DNA selezionato all'interno del campo visivo.

L'aspetto più difficile di questa procedura è quello di allineare correttamente i magneti per la geometria della forma. Un buon allineamento si ottiene spostando sistematicamente i magneti e testando l'allineamento dopo ogni passaggio, cosa che dimostreremo. Ora, esegui un allineamento del percorso del magnete nel carattere utilizzando le fasi di posizione per spostare manualmente i magneti nel software di visualizzazione del laboratorio.

Fare clic sul pulsante di registrazione per misurare le fluttuazioni o le escursioni della posizione XY. Le tracce registrate vengono visualizzate sullo schermo in tempo reale e salvate come file di testo che contengono le informazioni sulla posizione X, Y, Z. Se le escursioni XY seguono un arco come mostrato qui, il magnete cilindrico non è allineato correttamente, continuare a muovere il magnete cilindrico nella direzione appropriata e ad effettuare misurazioni fino a quando le fluttuazioni XY tracciano uno schema circolare completo, che indica che l'allineamento della rotta è stato raggiunto. Prossimo.

Se necessario per ulteriori esperimenti, eseguire un allineamento fine nel carattere utilizzando un tavolino automatizzato ad alta risoluzione per spostare la cella di flusso, allineando il magnete cilindrico entro circa 10 micron dalla perlina. Quindi, come prima, registra le escursioni XY. Continuare a muovere il tavolino e registrare le escursioni fino a quando le fluttuazioni sull'anulus circolare sono quasi uniformi.

Per verificare l'allineamento finale, utilizzare uno script MATLAB disponibile presso gli autori su richiesta per tracciare le fluttuazioni in un istogramma o in un termogramma e ispezionarne l'uniformità. Per misurare la coppia del DNA, rimuovere il magnete cilindrico utilizzato per il carattere e sostituirlo con un magnete cilindrico più un magnete laterale permanente. Per l'MTT, assicurarsi che il cavo del DNA selezionato rimanga all'interno del campo visivo.

Inserire il numero e la velocità di spire magnetiche nel pannello corrispondente del software di controllo lab view. Qui. Il numero di giri è impostato su cinque e la velocità è impostata su 0,1 hertz. Ciò farà sì che i magneti ruotino lentamente durante la misurazione.

Successivamente, in matlab, utilizza uno script di tracciamento angolare basato sul monitoraggio della posizione XY, disponibile presso l'autore su richiesta. Apparirà un grafico che mostra le fluttuazioni angolari in funzione del tempo, theta T. Una volta che tutto è impostato nella vista lab, fai clic sul pulsante di registrazione.

Le tracce appariranno in tempo reale come prima. In matlab, utilizzare lo script MATLAB per produrre grafici dell'angolo theta T e dell'altezza del cordone Z della traccia T sullo schermo con un adattamento gaussiano al segnale dell'angolo per determinare la deviazione standard delle fluttuazioni angolari. Sigma theta.

Questo script determina direttamente la rigidità dell'intrappolamento torsionale dalla varianza delle fluttuazioni angolari. Sigma theta al quadrato in radianti. Utilizzando la formula mostrata qui, si noti che è tipico nell'MTT raggiungere una rigidità della trappola rotazionale da 10 a 1000 pico newton nanometro per radiante, che è molto più bassa rispetto alle pinzette magnetiche convenzionali.

Qui, ad esempio, abbiamo determinato che la rigidità della trappola rotazionale è di circa 52 nanometri di maiale per radiante. La rigidità della trappola rotazionale delle pinzette magnetiche a coppia magnetica rispetto alle pinzette magnetiche convenzionali le rende adatte per le misurazioni della coppia di una singola molecola, ma significa anche che la coppia massima che può essere esercitata è ridotta. Ciò implica che l'MTT non è in grado di controbilanciare le coppie di trascinamento causate da una rotazione rapida.

Bisogna quindi fare attenzione a non ruotare troppo velocemente. In genere ruotiamo a velocità di circa 0,1 hertz. Successivamente, il cavo del DNA viene sopraffatto ruotando lentamente i magneti, un determinato numero di giri, e registrando un'altra traccia di fluttuazioni angolari, il numero e la velocità di giri del magnete vengono nuovamente inseriti nel pannello corrispondente del software di visualizzazione del laboratorio di controllo.

Qui il numero di giri è impostato su 40 e la velocità è impostata su 0,1 hertz. Ciò farà sì che i magneti ruotino lentamente durante la misurazione per determinare la coppia accumulata nel cavo dell'acido nucleico. Dopo N giri, usiamo la formula mostrata qui dove le parentesi angolari denotano la media e il theta zero.

E theta N sono l'angolo a zero spire corrispondente rispettivamente a un cavo torsionalmente rilassato e a una spira. Ripetere i passaggi in cui i magneti vengono ruotati e registrare un plateau di fluttuazioni angolari se necessario per determinare completamente la risposta toque di una molecola in un singolo ciclo di misurazione. Per misurare i cambiamenti nella torsione del DNA indotti dalla proteina di riparazione RAD 51, il cui legame con il DNA a doppio filamento, si allunga e si srotola.

Il DNA rad 51 è stato aggiunto a una molecola di DNA legata al font. Come mostrato qui, il cordone traccia una traiettoria a spirale. Questo movimento può essere disaccoppiato in componenti che descrivono come il DNA si allunga e si svolge nel tempo.

Per misurare la coppia immagazzinata nel DNA utilizzando l'MTT, la molecola con avvolgimento sistematico sopra e sotto e le fluttuazioni angolari sono state misurate per ogni numero di spire applicate. La deviazione standard delle fluttuazioni angolari, che riporta la rigidità dell'intrappolamento angolare, dovrebbe essere indipendente dal numero di spire applicate. Qui, la deviazione standard è di circa nove gradi, come mostrato qui.

La media delle posizioni angolari cambia sistematicamente con il numero di spire applicate utilizzando la rigidità dell'intrappolamento angolare costante. Le variazioni dell'angolo medio vengono convertite in coppia, ottenendo la coppia immagazzinata nel DNA rispetto alle spire applicate. La registrazione simultanea della posizione Z delle perline produce la lunghezza del DNA rispetto alle spire applicate.

Insieme, queste due curve producono la piena risposta meccanica del DNA all'avvolgimento sopra e sotto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare, torcere e torcere su molecole biologiche utilizzando le pinzette magnetiche a orbita libera e le pinzette magnetiche per nuovi saggi di singole molecole a cui le pinzette magnetiche convenzionali possono essere facilmente adattate. Lo sviluppo di queste tecniche apre la strada alla ricerca nel campo della biofisica, ad esempio, per studiare le proprietà torsionali del DNA o dell'RNA e per osservare processi come la compattazione e la riparazione del DNA. Le tecniche di font e MTT possono essere migliorate con altri metodi come il rilevamento della fluorescenza al fine di rispondere a ulteriori domande come determinare la posizione particolare di una proteina su un DNA legato.