Cura e manutenzione di base dei pulcini

Basic Chick Care and Maintenance

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Basic Chick Care and Maintenance

4.2: Introducing Experimental Agents into the Mouse

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06:42 min

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April 30, 2023

Overview

I pulcini (Gallus gallus domesticus) sono un prezioso strumento di ricerca, non solo per studiare concetti importanti nello sviluppo dei vertebrati, nelle neuroscienze e nella biologia dei tumori, ma anche come un sistema efficiente in cui propagare i virus. Sebbene le uova possano essere acquistate da fornitori esterni e lavorare con i pulcini richieda pochissime attrezzature specializzate, è necessaria una comprensione delle corrette procedure di manipolazione per il normale sviluppo dell’embrione.

Questo video fornirà una panoramica dei principi di gestione delle uova, inclusa una spiegazione dei parametri di incubazione che possono avere un impatto profondo sullo sviluppo: temperatura, umidità e rotazione delle uova. La maggior parte degli esperimenti che utilizzano uova di gallina richiedono l’accesso all’embrione all’interno del guscio, che si ottiene tagliando un piccolo foro richioibile o “finestra”. Questo processo è descritto in dettaglio passo-passo, insieme a molte altre tecniche essenziali per lavorare con i pulcini, come il candling e l’iniezione di inchiostro indiano. Infine, il video esaminerà alcune applicazioni pratiche di queste tecniche di base nella ricerca scientifica avanzata.

Procedure

Gli embrioni di pollo sono un ottimo modello per studiare lo sviluppo precoce dei vertebrati, in parte perché sono facili e poco costosi da mantenere. A differenza della maggior parte degli organismi modello, che vengono allevati in laboratorio, le uova di gallina fecondate vengono acquistate da un fornitore esterno. Inoltre, mantenere e lavorare con le uova richiede pochissime attrezzature specializzate. Questo video fornirà informazioni generali sull’acquisizione e il mantenimento delle uova di pulcino, le tecniche essenziali per lavorare con gli embrioni in via di sviluppo e alcune applicazioni pratiche di questi metodi.

Prima di discutere di lavorare con i pulcini in laboratorio, esaminiamo come le galline si prendono cura delle loro uova a casa. Sebbene le uova siano già fecondate quando vengono deposte, lo sviluppo dei pulcini si ferma quando le uova sono esposte a temperature esterne più fredde. Dopo aver deposto circa 12 uova, la gallina si siede sul nido per riprendere lo sviluppo dell’embrione. Durante la loro incubazione, la gallina ruoterà le uova per riscaldarle uniformemente e impedire all’embrione di attaccarsi al guscio. Se tutto va bene, 21 giorni dopo, la mamma si ha una nidiata di pulcini.

Quindi, come fanno gli scienziati a raccogliere abbastanza uova per i loro esperimenti? Micron… potrebbe volerci un po ‘ di tempo. Poiché i polli sono ampiamente addomesticati, le uova fecondate possono essere facilmente ottenute da un incubatoio o da un allevamento. Le uova possono anche essere ordinate in fasi specifiche dello sviluppo.

Una volta che le uova sono arrivate in laboratorio, possono essere conservate a 13 – 16 °C per un massimo di 5 giorni. Quando sei pronto per svilupparsi, lascia che le uova si scaldino a temperatura ambiente, quindi trasferiscile in un’incubatrice a dondolo a 37 ° C con il 60% di umidità fino a quando non hanno raggiunto lo stadio desiderato.

La maggior parte degli esperimenti eseguiti sui pulcini richiede alcuni passaggi preparatori, come controllare se le uova che hai ricevuto sono state fecondate in primo luogo. Un approccio semplice è quello di utilizzare una fonte di luce intensa o una scatola di candler per illuminare l’uovo. Utilizzando questa tecnica, nota come candling, è possibile visualizzare strutture interne come i vasi sanguigni per confermare la presente di un embrione.

Lasciare l’uovo intatto migliora la sopravvivenza del pulcino, ma il guscio impedisce l’accesso all’embrione. Per risolvere questo problema, i ricercatori usano una tecnica chiamata windowing.

Inizia deponendo le uova su un fianco e segnando la parte superiore per identificare il lato a cui salirà l’embrione. Per evitare danni al tuorlo durante il taglio di una finestra, una piccola quantità di albumina, o albume d’uovo, viene rimossa per abbassare l’embrione lontano dal guscio. Per fare questo, prima sterilizzare il guscio pulendolo con etanolo al 70%. Dopo che il guscio si è asciugato, lisciare un pezzo di nastro adesivo sull’estremità smussata dell’uovo. Quindi, utilizzare un ago sterile per perforare il nastro e il guscio. Inserire l’ago verso il basso per evitare di danneggiare il tuorlo e rimuovere 5 ml di albumina. Infine, per evitare perdite di albumina, sigillare il foro con un altro pezzo di nastro.

Per tagliare il guscio, posiziona un pezzo di nastro adesivo sopra l’area che prevedi di finestrare. Usando un paio di forbici, fai un piccolo foro nel guscio e inizia a tagliare un’apertura circolare. Durante questo processo, il nastro impedirà a frammenti di guscio di cadere sull’embrione.

Anche dopo la finestra, gli embrioni in fase iniziale possono essere difficili da visualizzare a causa delle loro piccole dimensioni e trasparenza. Per migliorare il contrasto tra l’embrione e il tuorlo, è possibile utilizzare inchiostro indiano diluito e non tossico. L’inchiostro viene iniettato nel tuorlo sotto l’embrione e lasciato diffondere. L’embrione può ora essere visto in maggiore contrasto con lo sfondo scuro. A seguito di manipolazioni sperimentali, la finestra deve essere risigillata con nastro adesivo e l’uovo riposto nell’incubatrice.

Ora che hai familiarità con le tecniche di base per lavorare con le uova, vediamo come questi metodi vengono utilizzati per condurre esperimenti sugli embrioni di pollo.

Per iniziare, il candling può essere utilizzato per identificare la posizione delle strutture embrionali in uova intatte. Ad esempio, le membrane extraembrionali dell’embrione di pollo sono comunemente utilizzate per la propagazione dei virus. Per infettare la membrana, viene eseguito il candling per localizzare l’interfaccia tra la cavità allantoica e la sacca d’aria, al fine di iniettare il virus direttamente nella cavità allantoica senza danneggiare l’embrione. Dopo alcuni giorni di incubazione, un gran numero di particelle virali può essere raccolto dal liquido allantoico.

La finestra delle uova è una pratica estremamente utile in quanto consente l’accesso all’embrione per la sperimentazione. Molti esperimenti iniziano con la consegna del DNA in tessuti specifici tramite microiniezione. Gli elettrodi vengono quindi posizionati attorno al tessuto di interesse e viene applicato un campo elettrico per permeabilizzare temporaneamente la membrana cellulare e guidare gli acidi nucleici nella cellula.

Quando si conducono esperimenti su embrioni precoci, l’iniezione di inchiostro indiano è particolarmente utile per visualizzare tessuti trasparenti. Qui, il contrasto migliorato consente ai ricercatori di microiniettare una soluzione di DNA in domini di tessuto raffinato. In definitiva, questa tecnica può produrre cellule etichettate individualmente, che possono essere monitorate nel tempo per tracciare le divisioni cellulari.

Hai appena visto il video di JoVE sulla manutenzione dei pulcini. Questa presentazione ha riguardato la manipolazione e la manutenzione di base delle uova di gallina, le tecniche comuni per lavorare con i pulcini e alcuni esempi di come questi metodi vengono applicati nella ricerca biologica. Grazie per l’attenzione!

Transcript

Chicken embryos are a great model for studying early vertebrate development, in part because they are easy and inexpensive to maintain. Unlike most model organisms, which are bred in the lab, fertilized chicken eggs are purchased from an external supplier. Additionally, maintaining and working with the eggs requires very little specialized equipment. This video will provide general background on the acquisition and maintenance of chick eggs, techniques essential to working with developing embryos, and some practical applications of these methods.

Before we discuss working with chicks in the lab, lets review how hens care for their eggs at home. Although eggs are already fertilized when they are laid, chick development stops when the eggs are exposed to colder external temperatures. After laying about 12 eggs the hen sits on the nest to resume embryo development. During their incubation, the hen will rotate the eggs to warm them evenly and prevent the embryo from sticking to the shell. If all goes well, 21 days later, mom has herself a brood of chicks.

So how do scientists collect enough eggs for their experiments? Um… that could take a while. Because chickens are widely domesticated, fertilized eggs can be easily obtained from a hatchery or breeding farm. Eggs can even be ordered at specific developmental stages.

Once eggs have arrived in the lab, they can be stored at 13 – 16 °C for up to 5 days. When you’re ready for them to develop, allow the eggs to warm to room temperature, then transfer them to a rocking incubator at 37 °C with 60% humidity until they’ve reached the desired stage.

Most experiments performed on chicks require a few preparatory steps, like checking if the eggs you received were fertilized in the first place. An easy approach is to use a bright light source or candler box to illuminate the egg. Using this technique, known as candling, internal structures such as blood vessels can be visualized to confirm that an embryo is present.

Leaving the egg intact improves chick survival, but the shell prevents access to the embryo. To crack this problem, researchers use a technique called windowing.

Begin by laying the eggs on their side and marking the top to identify the side to which the embryo will rise. To prevent damage to the yolk while cutting a window, a small amount of albumin, or egg white, is removed to lower the embryo away from the shell. To do this, first sterilize the shell by wiping it down with 70% ethanol. After the shell has dried, smooth a piece of tape over the blunt end of the egg. Then, use a sterile needle to pierce the tape and shell. Insert the needle downwards to avoid damaging the yolk and remove 5 ml of albumin. Lastly, to prevent leakage of albumin, seal the hole with another piece of tape.

To cut the shell, place a piece of tape over the area you plan to window. Using a pair of scissors, make a small hole in the shell and begin to cut a circular opening. During this process, the tape will prevent fragments of shell from falling onto the embryo.

Even after windowing, early stage embryos can be hard to visualize due to their small size and transparency. To improve contrast between the embryo and yolk, diluted, non-toxic India ink can be used. The ink is injected into the yolk under the embryo and allowed to diffuse. The embryo can now be seen in higher contrast against the dark background. Following experimental manipulations, the window should be resealed with tape and the egg placed back into the incubator.

Now that you’re familiar with basic techniques for working with eggs, lets see how these methods are used to conduct experiments on chicken embryos.

To start, candling can be used to identify the location of embryonic structures in intact eggs. For example, the extraembryonic membranes of the chicken embryo are commonly used for the propagation of viruses. To infect the membrane, candling is performed to locate the interface between the allantoic cavity and the air sac, in order to inject virus directly into the allantoic cavity without damaging the embryo. After a few days of incubation, large numbers of viral particles can be harvested from the allantoic fluid.

Egg windowing is an extremely useful practice as it permits access to the embryo for experimentation. Many experiments begin with the delivery of DNA into specific tissues via microinjection. Electrodes are then placed around the tissue of interest and an electric field is applied to temporarily permeabilize the cell membrane and drive the nucleic acids into the cell.

When conducting experiments on early embryos, India ink injection is especially useful for visualizing transparent tissues. Here, the improved contrast allows researchers to microinject a DNA solution into refined tissue domains. Ultimately, this technique can produce individually labeled cells, which can be monitored over time to track cell divisions.

You’ve just watched JoVE’s video on chick maintenance. This presentation has covered basic handling and maintenance of chicken eggs, common techniques for working with chicks and some examples of how these methods are applied in biological research. Thanks for watching!

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