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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

In ovo Elettroporazione di embrioni di pollo

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

In ovo Electroporation of Chicken Embryos

4.10: Mouse Genotyping

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

24,765 Views

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06:57 min

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April 30, 2023

Overview

L’elettroporazione è una tecnica utilizzata nella ricerca biomedica che consente la manipolazione dell’espressione genica attraverso la consegna di materiale genetico estraneo nelle cellule. Più specificamente, in ovo l’elettroporazione viene eseguita su pulcini in via di sviluppo precoce (Gallus gallus domesticus) contenuti all’interno dei loro gusci d’uovo. In questa procedura, il DNA o i costrutti di knockdown vengono prima iniettati in un tessuto bersaglio. Tuttavia, il materiale genetico non è in grado di penetrare nella membrana plasmatica per svolgere la sua funzione all’interno della cellula. Per risolvere questo problema, viene applicato un campo elettrico, causando interruzioni temporanee della stabilità della membrana. Questo campo elettrico fa anche sì che gli acidi nucleici caricati negativamente migrino verso l’elettrodo caricato positivamente attraverso i fori nella membrana plasmatica, guidando così efficacemente il DNA o il costrutto di knockdown nella cellula. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la consegna di materiale genetico può essere localizzata in tipi di cellule isolate in specifici punti temporali dello sviluppo. Di conseguenza, i meccanismi genetici che governano gli eventi di sviluppo individuali possono essere esaminati.

Questo video fornisce una panoramica dei principi alla base dell’elettroporazione ovo e introduce gli strumenti necessari per la tecnica, inclusi aghi capillari, elettrodi e un elettroporatore. Un protocollo passo-passo per l’esecuzione della procedura viene anche presentato prima della discussione di alcuni esempi affascinanti di come la tecnica viene utilizzata per eseguire una varietà di manipolazioni genetiche negli embrioni di pollo.

Procedure

L’elettroporazione è una tecnica utilizzata per introdurre materiale genetico estraneo nelle cellule. L’elettroporazione degli embrioni di pulcino all’interno dell’uovo, o nell’elettroporazione ovo, è uno strumento prezioso per i biologi dello sviluppo perché la consegna di materiale genetico può essere localizzata in tessuti specifici e punti temporali specifici dello sviluppo. Questo video introdurrà i principi di base dell’elettroporazione in ovo, descriverà i passaggi essenziali della procedura e discuterà di come questa tecnica può essere utilizzata per studiare i processi biologici durante lo sviluppo.

Per iniziare, esaminiamo i principi di base dell’elettroporazione per capire come può essere usato per ottenere il DNA in una cellula.

In primo luogo, la microiniezione viene utilizzata per fornire il DNA in prossimità di una cellula di interesse. Tuttavia, il DNA non può penetrare nella membrana plasmatica per entrare nella cellula.

Per risolvere questo problema, viene applicata una corrente elettrica per interrompere la stabilità della membrana, creando pori. Una seconda conseguenza di questo campo elettrico è la migrazione del DNA caricato negativamente verso l’elettrodo positivo. Di conseguenza, solo le cellule sul lato del sito di iniezione più vicino all’elettrodo positivo vengono trasfettate con il DNA.

Ora che conosci i principi di base, parliamo di come preparare gli embrioni per l’elettroporazione. Se hai bisogno di utilizzare embrioni più vecchi dello stadio 20 di Hamburger Hamilton, è meglio colturare i tuoi pulcini al di fuori del guscio, o ex ovo,per un migliore accesso ai tessuti. Questo video si concentrerà sulle elettroporazioni eseguite su embrioni precoci che si sviluppano all’interno del guscio o in ovo.

Per iniziare, le uova devono essere incubate in un incubatore umidificato a 37 °C fino a quando non hanno raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato. Mentre le uova sono in incubazione, preparare gli strumenti per l’iniezione e l’elettroporazione. In primo luogo, creare aghi capillari tirando un pipetto di vetro da 0,5 mm con un estrattore di pipetta. Per aprire la pipetta, posizionarla al microscopio e rompere un piccolo pezzo della punta. Quindi, preparare la soluzione di iniezione, che dovrebbe contenere una diluizione appropriata del costrutto e un colorante per aiutare a visualizzare la soluzione iniettata.

Per controllare il movimento del fluido all’interno dell’ago, collegarlo a una pipetta orale alimentata dall’uomo. In alternativa, l’ago può essere caricato su un microiniettore, che fornisce impulsi d’aria a pressione regolabili. Riempire l’ago immergendo la punta nella soluzione iniettabile e applicando una pressione negativa.

Oltre agli aghi, avrai anche bisogno di elettrodi. Questi sono costituiti da due fili esposti fissati insieme da un adattatore. Una coppia di cavi collega gli elettrodi al generatore di impulsi elettrici, o elettroporatore, che controlla la durata, la frequenza e la tensione dell’impulso. Per il funzionamento a mani libere, l’elettroporatore può essere attivato da un pedale.

Una volta che le uova sono pronte, tagliare una finestra nel guscio e aggiungere alcune gocce di soluzione salina fisiologica, come Hanks, per evitare che l’embrione si secchi. Al microscopio, posizionare l’uovo in modo tale che il tessuto di interesse sia accessibile all’ago. Quindi, perforare l’embrione con l’ago capillare e fornire la soluzione applicando una leggera pressione.

Ora che abbiamo iniettato il costrutto, è il momento di eseguire l’elettroporazione. Posiziona gli elettrodi in modo che siano immersi nella soluzione di Hank e il tessuto di interesse sia centrato tra di loro. Per applicare la corrente elettrica, premere il pedale e cercare le bolle che si formano intorno agli elettrodi.

Una volta completata l’elettroporazione, rimuovere gli elettrodi dall’embrione e pulirli con etanolo al 70%. Aggiungere alcune gocce di soluzione salina integrata con antibiotici per prevenire l’infezione e sigillare la finestra con del nastro adesivo. Infine, rimettete le uova nell’incubatrice per uno sviluppo continuo prima dell’analisi fenotipica.

Ora che abbiamo imparato tutto sull’elettroporazione ovo, diamo un’occhiata ad alcuni esempi di come gli scienziati stanno applicando questa tecnica nella ricerca sullo sviluppo.

Per iniziare, l’elettroporazione può essere utilizzata per bloccare l’espressione genica mediante la consegna di costrutti di knockdown. In questo esempio, le cellule del tubo neurale in via di sviluppo sono state elettroporate con costrutti di silenziamento genico. Agli embrioni è stato permesso di svilupparsi, e quindi le traiettorie assonali sono state confrontate tra campioni normali e knockdown per valutare il controllo genetico della guida assonale.

Il rovescio della medaglia, in ovo l’elettroporazione può anche essere utilizzata per esprimere una proteina in un sottoinsieme di cellule introducendo un plasmide contenente un gene che codifica per la proteina e un promotore: una sequenza che lega l’RNA polimerasi per avviare la trascrizione. Qui, gli scienziati hanno consegnato un singolo gene nelle cellule del cervello embrionale. La colorazione dei tessuti per rilevare sia il prodotto proteico di questo gene che i marcatori di specifici sottotipi neurali mostra che il gene elettropoato altera lo sviluppo neurale.

I costrutti del DNA che codificano le proteine fluorescenti possono anche essere introdotti mediante elettroporazione per visualizzare cellule e strutture durante lo sviluppo. Ciò consente l’imaging dal vivo di processi complessi, come lo sviluppo del midollo spinale, fornendo informazioni sulle dinamiche dei movimenti cellulari nel tempo.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE all’elettroporazione in ovo, una tecnica utile per consegnare materiale genetico ai pulcini. Questo video ha discusso i principi di base dell’elettroporazione, i passaggi necessari per iniettare ed elettroporare i pulcini e le applicazioni di questa tecnica nell’attuale ricerca sullo sviluppo. Grazie per l’attenzione!

Transcript

Electroporation is a technique used to introduce foreign genetic material into cells. Electroporation of chick embryos inside the egg, or in ovo electroporation, is a valuable tool for developmental biologists because the delivery of genetic material can be localized to specific tissues and specific developmental time points. This video will introduce the basic principles of in ovo electroporation, describe essential steps of the procedure, and discuss how this technique can be used to study biological processes during development.

To start, let’s review the basic principles of electroporation to figure out how it can be used to get DNA into a cell.

First, microinjection is used to deliver the DNA in close proximity to a cell of interest. However, the DNA can’t penetrate the plasma membrane to get into the cell.

To solve this problem, an electrical current is applied to disrupt the stability of the membrane, creating pores. A second consequence of this electric field is the migration of the negatively charged DNA towards the positive electrode. As a result, only cells on the side of the injection site closer to the positive electrode become transfected with the DNA.

Now that you know the basic principles, let’s talk about how to prepare embryos for electroporation. If you need to use embryos older than Hamburger Hamilton stage 20, it’s best to culture your chicks outside of the shell, or ex ovo, for improved tissue access. This video will focus on electroporations performed on early embryos developing within the shell, or in ovo.

To begin, eggs should be incubated in a humidified incubator at 37 °C until they have reached the desired developmental stage. While the eggs are incubating, prepare the tools for injection and electroporation. First, make capillary needles by pulling a 0.5 mm glass pipet with a pipet puller. To open the pipet, place it under a microscope and break off a small piece of the tip. Then, prepare the injection solution, which should contain an appropriate dilution of your construct as well as a dye to help you visualize the injected solution.

To control the movement of fluid within the needle, attach it to a human-powered mouth pipet. Alternatively, the needle can be loaded onto a microinjector, which provides adjustable pressure pulses of air. Fill the needle by submerging the tip in the injection solution and applying negative pressure.

In addition to needles, you’ll also need electrodes. These consist of two exposed wires fixed together by an adaptor. A pair of cables connects the electrodes to the electric pulse generator, or electroporator, which controls the pulse duration, frequency, and voltage. For hands free operation, the electroporator can be activated by a foot pedal.

Once the eggs are ready, cut a window in the shell, and add a few drops of physiological salt solution, such as Hanks, to prevent the embryo from drying out. Under a microscope, position the egg such that the tissue of interest is accessible to the needle. Then, pierce the embryo with the capillary needle and deliver the solution by applying gentle pressure.

Now that we’ve injected the construct, it’s time to perform the electroporation. Position the electrodes so that they are submerged in the Hank’s solution and the tissue of interest is centered between them. In order to apply the electrical current, press the foot pedal and look for bubbles forming around the electrodes.

Once the electroporation is complete, remove the electrodes from the embryo and wipe them down with 70% ethanol. Add a few drops of salt solution supplemented with antibiotics to prevent infection, and seal the window with tape. Finally, place the eggs back in the incubator for continued development prior to phenotypic analysis.

Now that we’ve learned all about in ovo electroporation, let’s look at some examples of how scientists are applying this technique in developmental research.

To begin, electroporation can be used to block gene expression by delivery of knockdown constructs. In this example, cells of the developing neural tube were electroporated with gene silencing constructs. The embryos were allowed to develop, and then axon trajectories were compared between normal and knockdown samples to assess the genetic control of axon guidance.

On the flipside, in ovo electroporation can also be used to express a protein in a subset of cells by introducing a plasmid containing a protein-encoding gene and a promoter: a sequence which binds RNA polymerase to initiate transcription. Here, scientists delivered a single gene into cells of the embryonic brain. Tissue staining to detect both the protein product of this gene and markers of specific neural subtypes shows that the electroporated gene alters neural development.

DNA constructs encoding fluorescent proteins can also be introduced by electroporation to visualize cells and structures during development. This allows for live imaging of complex processes, such as spinal cord development, giving insight into the dynamics of cell movements over time.

You’ve just watched JoVE’s introduction to in ovo electroporation, a useful technique for delivering genetic material into chicks. This video discussed the basic principles of electroporation, steps required to inject and electroporate chicks, and applications of this technique in current developmental research. Thanks for watching!

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