Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

L'obiettivo generale di questa procedura è sequenziare 16 S-R-R-N-A. Geni amplificati da campioni ambientali utilizzando una macchina di sequenziamento da banco. Ciò si ottiene amplificando prima il gene 16 S-R-R-N-A utilizzando primer modificati.

Il secondo passo consiste nel purificare i prodotti di amplificazione, quantificarli e raggrupparli. Successivamente, il pool di ampliconi viene attaccato a sfere di sequenziamento amplificate clonalmente durante la PCR in emulsione e sequenziate su un sequenziatore da banco. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i set di dati della sequenza risultanti.

Alla fine 16 S-R-R-N-A. Il sequenziamento dell'amplicone genico viene utilizzato per determinare la composizione e la diversità della comunità microbica in un campione ambientale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il DGG o il sequenziamento di clonazione, è che offre una prospettiva più profonda e chiara sulla composizione e la diversità della comunità microbica.

Questo metodo può aiutarti a rispondere a una delle domande chiave nell'ecologia microbica, chi c'è per iniziare i primer avanti e indietro? I due X hot start tac plus master mix e i campioni, la sequenza dei primer avanti e indietro si adattano al modello mostrato. La sequenza contiene adattatori specifici per torrent ionici.

Una chiave di sequenziamento per calibrare l'intensità del segnale all'inizio del sequenziamento. Esegui un primer specifico per il modello e un codice a barre da 10 coppie di basi. Quindi mescolare accuratamente i primer e i campioni prima dell'uso.

Preparare una reazione PCR. Miscelare 20 microlitri per reazione contenenti 0,5 micromolari di primer inverso, 0,4 milligrammi per millilitro di BSA e un X hot start tac plus master mix. Quindi, pipettare 18,5 microlitri della miscela master in ciascuna provetta PCR, aggiungere 0,5 microlitri di una soluzione madre di primer in avanti da 20 millimolari contenente un codice a barre diverso per ciascuno dei campioni che verranno sequenziati insieme.

Quindi, al di fuori della cappa per PCR, aggiungere un microlitro di un campione a una concentrazione da uno a 10 nanogrammi per microlitro alla provetta per PCR. Impostare un programma con una denaturazione iniziale di 95 gradi Celsius per cinque minuti. Poi 25 cicli a 95 gradi Celsius per 30 secondi.

55 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per 45 secondi. L'allungamento finale dovrebbe essere a 72 gradi Celsius per 10 minuti. Posizionare le provette in una macchina per PCR e avviare il programma.

I prodotti finali della PCR possono essere posizionati a quattro gradi Celsius o a 20 gradi Celsius negativi fino al momento dell'utilizzo. Preparare un gel al 2% di aros utilizzando i pettini più grandi disponibili. Quindi mescolare cinque microlitri di sei coloranti di caricamento del gel con ogni reazione PCR e caricare i campioni sul gel separando ogni campione da un vuoto.

Eseguire bene il gel a 70 volt per 50 minuti. Dopo che il gel è stato analizzato, scatta una foto del gel e taglia le bande usando un bisturi. Ogni banda dovrebbe essere di circa 250 coppie di basi, che contiene un prodotto da 190 coppie di basi con 63 coppie di basi che compongono gli adattatori e i codici a barre.

Successivamente, pesare le bande asportate e procedere con l'estrazione del gel e la purificazione dei prodotti della PCR. Utilizzando un kit come il kit di estrazione rapida del gel per kayak, quantificare ogni prodotto PCR con pico green ed effettuare diluizioni per ottenere una soluzione madre da cinque volte 10 al nono di molecole per microlitro, che è circa un nanogrammo per microlitro. Se alcuni campioni mostrano un'amplificazione inferiore, regolare la concentrazione secondo necessità, ma non scendere al di sotto di 1,57 volte 10 al settimo di molecole per microlitro.

Raggruppare 10 microlitri di ciascun prodotto PCR diluito per ottenere un pool molare uguale di campioni, preparare un pool separato per ciascuna delle esecuzioni di sequenziamento pianificate. I prodotti PCR in pool possono essere conservati in congelatore fino al momento dell'utilizzo per eseguire l'emulsione. Per prima cosa la PCR, diluire i prodotti PCR aggregati a 26 picaMolari in un volume di 25 microlitri e prelevare i reagenti da un kit di maschere PGM ioniche.

Quindi lavorare in una cappa per PCR e preparare l'emulsione PCR. Mescolando i prodotti PCR in pool, è possibile aggiungere le particelle di sfera quando si lavora al banco. Mescolare accuratamente la soluzione, quindi inserire la miscela in una cartuccia filtrante e guarnire accuratamente con olio emulsionante.

Quindi, capovolgere lentamente la cartuccia del filtro e caricare la cartuccia sull'apparecchio PCR automatizzato per emulsione. Quindi selezionare il programma appropriato e avviare la procedura. Al termine della PCR automatizzata dell'emulsione, rimuovere il surnatante dalle provette di raccolta e recuperare le particelle sferiche sul fondo delle provette. Resus.

Sospendi le sfere in 100 microlitri di soluzione di lavaggio e preleva un'aliquota da due microlitri per la quantificazione della libreria. Per sequenziare i prodotti PCR, preparare un piano di sequenziamento che specifichi i dettagli del sequenziamento. Quindi aprire lo strumento, fare clic su inizializza e, quando richiesto, installare la soluzione di lavaggio numero due, la soluzione di lavaggio numero uno e la soluzione tampone pH automatica nello strumento di sequenziamento.

Successivamente, continuare la procedura di inizializzazione e, quando richiesto, aggiungere i nucleotidi D-A-T-P-D-G-T-P-D-C-T-P e DTTP nelle rispettive provette da 50 millilitri. Quindi avvitare le provette sulla sequenziatrice e continuare la procedura di inizializzazione. Una volta completata la procedura di inizializzazione, avviare immediatamente la procedura di caricamento dei campioni per preparare i campioni per il sequenziamento.

Centrifugare le sfere arricchite dall'emulsione PCR a 15, 500 volte G per 1,5 minuti per raccogliere le sfere sul fondo della provetta. Quindi rimuovere la S natin e lasciare esattamente tre microlitri nel tubo. Quindi, aggiungere tre microlitri di primer di sequenziamento alla provetta e pipettare su e giù per risospendere le particelle e mescolare accuratamente la soluzione.

Incubare la provetta per due minuti a 95 gradi Celsius e poi per due minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere un microlitro di polimerasi e mescolare bene, quindi incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Durante l'incubazione della miscela, caricare il chip di sequenziamento sul sequenziatore ed eseguire un controllo di qualità del chip.

Quindi rimuovere il liquido dal truciolo con una centrifugazione rapida e una microcentrifuga. Caricare il campione nel chip pipettando lentamente sette microlitri della miscela di sfere enzimatiche ed evitando di introdurre bolle nel chip. Una volta caricato il campione nel chip, posizionarlo nello strumento e avviare la corsa di sequenziamento.

Per iniziare l'analisi dei dati, connettersi al server dei dati di sequenziamento e scaricare il file Q veloce. Quindi crea una scheda, un file oligo delimitato contenente il primer e le informazioni sul codice a barre. Quindi, scarica i file di riferimento di Green Genes dal sito Web principale, avvia la madre ed esegui l'analisi.

Converti i file FASTQ in un file veloce di qualità utilizzando il comando mostrato nella parte inferiore dello schermo. Determinare l'appartenenza al gruppo di ogni sequenza e tagliare le sequenze. Utilizzando questo comando, classificare quindi le sequenze nella tassonomia dei geni verdi.

Utilizzando questo comando, l'output medio durante il sequenziamento utilizzando una nave tre 14 su un PGM torrent ionico è compreso tra 0,3 e 0,5 milioni. Letture di buona qualità dopo che i risultati sono stati filtrati in madre. Ecco una tipica ripartizione del numero di letture dopo ogni fase di questa procedura di sequenziamento di nuova generazione mostrata qui è la composizione media della comunità a livello di classe phylum di tutti i 36 campioni ambientali multiplex che sono stati amplificati con primer mirati alla regione V da tre a quattro del ribosoma 16 s e analizzati utilizzando il master madre One.

Questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sequenziare 16 candidati di RNA ribosomiale utilizzando una macchina di sequenziamento da banco.