Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare colture ex vivo di drosofila, testicoli della pupilla e cisti germinali per eseguire studi di imaging dal vivo e trattamenti inibitori per analizzare il post miotico Per la miogenesi, ciò si ottiene sezionando prima i testicoli intatti fin dalle prime 24 ore dopo la formazione del purium. Il secondo passo consiste nel sezionare singole cisti germinali da questi testicoli, quindi i testicoli intatti e le singole cisti germinali possono essere utilizzati per esperimenti di imaging dal vivo. In alternativa, il passo successivo consiste nell'incubare i testicoli intatti o la cisti germinale con composti inibitori.

Infine, la colorazione immunologica della zucca, i testicoli e la microscopia a fluorescenza vengono utilizzati per monitorare l'effetto del trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica di coltura ex vivo rispetto ai metodi genetici esistenti è che consente l'accesso alla spermatogenesi con dilo durante le fasi post miotiche. In generale, gli individui nuovi a questo metodo hanno difficoltà a causa di alcune esperienze necessarie per sezionare e gestire i tessuti della pupilla.

Per iniziare l'esperimento, distribuire gocce di 80 microlitri di scudi e San M tre insetto con siero fetale bovino e antibiotici in una capsula di Petri di 10 centimetri. Quindi, usando un paio di pinze larghe, raccogli una pupa e trasferiscila in una goccia di terreno sul piatto. Quindi trasferire i materiali su uno stereomicroscopio dotato di un illuminatore a fibre ottiche.

Fare attenzione a non riscaldare i testicoli oltre la temperatura ambiente durante la dissezione utilizzando una pinza numero cinque. Afferra la pupa nella sua estremità più posteriore e tienila in posizione. Afferra le sferiche anteriori con un altro paio di pinze e apri la pupilla con una permanente alla sua estremità anteriore.

Staccare la custodia della pupilla fino a quando almeno una parte del torace è esposta. Continua a tenere la pupa in posizione dalla sua estremità più posteriore e rilascia la pressione interna della pupa inserendo entrambe le braccia di un paio di pinze nella regione della testa della pupa. Quindi, apri la pupa aprendo il forcipe e muovendo il forcipe nella direzione anteriore e assicurati che l'apertura sia il più grande possibile al primo tentativo.

Evitare di danneggiare la pupa alla sua estremità posteriore prima che la pressione sia stata rilasciata. In quanto ciò potrebbe comportare che i testicoli vengano spinti direttamente attraverso la piccola apertura e danneggiati. Una volta aperta la pupa, la pressione interna rilasciata dalla pupa spinge fuori il glomerato delle cellule e dei tessuti adiposi attraverso la grande apertura.

Quindi aumentare le dimensioni dell'apertura utilizzando un paio di pinze ed evitare di schiacciare la pupa con la pinza in quanto ciò potrebbe danneggiare i testicoli. Quindi, tieni chiusa la pupa alla sua estremità più posteriore. L'altro paio di pinze e striare delicatamente il contenuto della pupa da posteriore a anteriore per rilasciare i testicoli dalla pupa.

Controllare se i testicoli delle pupille sono stati espulsi. Non saranno collegati a nessun altro tessuto. A 24 ore A PF raccoglie i testicoli con un puntale per pipetta pretagliato da 200 microlitri.

Trasferire solo una piccola quantità di terreno per ridurre il numero di cellule adipose trasportate con i testicoli. Quindi mettere i testicoli in terreno in un piatto di coltura fresco. Lavare i testicoli più volte con un terreno fino a quando rimangono solo poche cellule adipose per l'imaging dal vivo.

Trasferire i testicoli in una piastra di coltura con fondo di vetro con terreno e utilizzare un microscopio per immagini invertito per iniziare la dissezione. Trasferire uno o più testicoli delle pupille in una piastra di coltura con fondo di vetro riempita di terreno. Utilizzare uno stereomicroscopio con illuminazione a fibre ottiche e due aghi in acciaio inossidabile per la dissezione delle cisti germinali maschili.

Con un ago accuratamente bloccato, un testicolo si trova all'estremità anteriore o posteriore e lo tiene in posizione. Inserisci l'altro ago nel testicolo e rompi la guaina del testicolo spostando l'ago lateralmente, il che rilascerà molte delle cisti. Continua a tenere un testicolo in posizione con un ago.

Quindi usa l'altro ago per striare delicatamente le cisti rimanenti dal testicolo. Successivamente separare le cisti aggregate. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri trasferendo le cisti in un piatto di coltura fresco con terreno.

Quindi spostare il piatto coltivato su un microscopio a imaging invertito per l'imaging dal vivo di singole cisti. Disperdere nuovamente le cisti con un ago se necessario, identificare lo stadio delle cisti utilizzando la microscopia a contrasto di fase e a fluorescenza. Concentrati su una cisti dello stadio desiderato.

Confermare frequentemente la messa a fuoco e la posizione della cisti. Durante gli esperimenti di imaging più lunghi, le cisti non aderiscono al fondo del piatto di coltura. Intendo fluttuare fuori fuoco.

Riempire ogni pozzetto di una piastra di coltura cellulare da 24 pozzetti con 500 microlitri di terreno per un esperimento di 12 repliche. Quindi trasferire un testicolo pupillare in ciascun pozzetto utilizzando un puntale per pipetta pretagliato da 200 microlitri. Successivamente, verificare la presenza di protamina nei testicoli isolati utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.

I testicoli devono essere privi di protamina, segnale B-E-G-F-P, che indica che l'interruttore da hisone a protamina o HP non ha avuto luogo in nessuna delle cisti. Sostituire i testicoli che mostrano già cisti positive. Aggiungere 500 microlitri di terreno contenente acido endocarico, il composto inibitore per raggiungere una concentrazione finale di 150 micromolari in un millilitro a ciascuno dei primi 12 pozzetti.

Utilizzare i pozzetti rimanenti come controlli non trattati aggiungendo 500 microlitri di terreno con solvente. Quindi incubare la piastra a cinque gradi Celsius per 24 ore al buio. Controllare nuovamente la presenza di protamina nei testicoli incubati.

I testicoli di controllo dovrebbero ora mostrare una o più cisti positive alla protamina, B-E-G-F-P, che indica una transizione attraverso l'interruttore HP. Successivamente, utilizzando una pipetta con puntale da 200 microlitri, trasferire i testicoli su vetrini rivestiti di poli L lisina. Eseguire preparazioni di zucca e colorare con anticorpi fluorescenti.

Seguendo i protocolli pubblicati, sono state ottenute immagini a contrasto di fase dei testicoli di Drosophila utilizzando questo metodo di dissezione. Si tratta di un testicolo intero leggermente schiacciato di una pupa di drosophila. A 24 ore dalla formazione di PY o di un PF, gli spermatogoni sono limitati alla punta anteriore sotto la regione del mozzo.

Il testicolo rimanente è pieno di spermatociti, spermatidi nello stadio corrente di Nevin con nuclei rotondi e spermatidi in stadi allungati con sovrapposizioni di flagelli crescenti di contrasto di fase, immagini fluorescenti EGFP e RFP da testicoli pupillari montati a casa sono state ottenute per rilevare H due A-V-D-R-F-P e protamina B-E-G-F-P a 24 ore A PF. Nessuno degli spermatidi ha subito frequentemente il passaggio all'HP. I testicoli sezionati in questa fase contengono una struttura di autofluorescenza. Un testicolo pupillare viene sezionato 36 ore A PF mostra la prima protamina, cisti B-E-G-F-P positiva.

I testicoli delle pupille 48 ore Un PF presenta diverse cisti germinali con nuclei positivi alla protamina visibili. È possibile registrare immagini dal vivo in time-lapse ex vivo di interi testicoli che si sviluppano in coltura. Utilizzando questo metodo, un testicolo pupillare è stato sezionato per 45 ore e un PF incubato in terreno per sei ore e sottoposto a imaging ogni cinque minuti.

Entro questo lasso di tempo, diverse cisti di spermatidi emergono dallo stadio di commutazione HP e mostrano un segnale luminoso di protamina B-E-G-F-P. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere il testicolo della pupilla precoce e la singola cisti germinale in coltura al fine di eseguire l'imaging in vivo o trattamenti con inibitori.