Flussi di minerali nutrienti e sostanze tossiche in misura Piante con traccianti radioattivi

In pianta, la misurazione dei flussi di nutrienti e sostanze tossiche è essenziale per lo studio della nutrizione e della tossicità delle piante. Qui, trattiamo i protocolli radiotraccianti per la determinazione dell'afflusso e dell'efflusso nelle radici delle piante intatte, utilizzando come esempi i flussi di potassio (K⁺) e ammoniaca/ammonio (NH₃/NH₄⁺). Vengono discussi i vantaggi e i limiti di tali tecniche.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di misurare i flussi unidirezionali di potassio e ammoniaca dentro e fuori le radici di piantine di orzo intatte e di caratterizzare il funzionamento dei principali sistemi di trasporto dei nutrienti nelle membrane delle piante. Ciò si ottiene coltivando prima le piantine per una settimana in soluzioni idroponiche di composizione chimica specifica per garantire che le piante siano in uno stato nutrizionale stazionario. La coltura idroponica consente alle radici di essere accessibili per la manipolazione sperimentale.

Come seconda fase, le radici di piante intatte vengono immerse per periodi di tempo variabili in soluzioni sperimentali, comprese le soluzioni di assorbimento, che hanno il substrato di interesse addizionato con il suo isotopo radioattivo. Questo passaggio verrà utilizzato per determinare le velocità di trasporto dentro e fuori le piantine. Successivamente, le piante vengono sezionate immediatamente dopo un breve periodo di assorbimento per esperimenti di afflusso unidirezionale o trasferite in un imbuto FLX dopo un assorbimento più lungo per misurare il rilascio di traccianti.

Utilizzando l'analisi compartimentale mediante tracciante, flx o Kate, si ottengono risultati che possono rivelare aspetti chiave della capacità, dell'energia, dei meccanismi e della regolazione dei sistemi di trasporto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alla fisiologia nutrizionale delle piante, ad esempio come vengono trasportati i nutrienti minerali e le sostanze tossiche dentro e fuori le piante? In che modo tali flussi rispondono ai cambiamenti ambientali e in che modo influenzano la compartimentazione cellulare e tissutale del substrato?

E infine, in che modo gli stress abiotici che compromettono gli ambienti ecologici in agricoltura, come la salinità, la siccità e la tossicità dei metalli pesanti, influenzano i flussi e le dinamiche dei nutrienti delle piante. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i saggi di deplezione o accumulo del substrato o le misure con elettrodi vibranti selettivi per il ferro è che siamo in grado di misurare i flussi unidirezionali rispetto alle flessioni nette, che è una differenza tra afflusso ed eFlex. In questo modo, siamo in grado di ottenere preziose informazioni sulla capacità energetica, sui meccanismi e sulla regolazione dei sistemi di trasporto dei nutrienti e delle sostanze intossicanti delle piante.

La specie modello di orzo verrà utilizzata in questo esperimento, coltivare le piantine di orzo idroponicamente per sette giorni in una camera di crescita a clima controllato un giorno prima dell'esperimento raggruppare diverse piantine insieme per creare un'unica replica. Avvolgi un pezzo di tubo tigon di due centimetri attorno alla parte basale degli scivoli e fissa il tubo con del nastro adesivo per creare un collare. Utilizzare tre piante per fascio per l'afflusso diretto o il saggio DI e sei piante per fascio per l'analisi compartimentale mediante tracciante, flx o saggio Kate un giorno prima dell'esperimento.

Preparare i seguenti materiali e soluzioni per l'addizione dionda, raccogliere soluzioni di pre-etichettatura, etichettatura e desorbimento, provette da centrifugazione e fiale di campioni, aerare e miscelare tutte le soluzioni per Kate. Raccogli bene quanto segue. Soluzioni di etichettatura ed eluizione aerate miste, imbuti di efflusso, provette per centrifugazione e fiale per campioni.

Preparare i traccianti radio il giorno dell'esperimento seguendo tutti i requisiti della licenza per i materiali radioattivi dell'istituto. Indossare dispositivi di sicurezza e dosimetri adeguati e utilizzare una schermatura appropriata per la preparazione dell'isotopo radioattivo del potassio. Potassio 42.

Posizionare un becher pulito e asciutto sulla bilancia e azzerare la bilancia. Estrarre un flaconcino del tracciante dalla confezione e versare la polvere nel becher. Prendere nota della pipetta di massa, 19,93 millilitri di acqua distillata nel becher, seguiti da 0,07 millilitri di acido solforico.

Successivamente, viene calcolata la concentrazione della soluzione stock radioattiva. Data la massa e il peso molecolare del carbonato di potassio e il volume della soluzione, utilizzare un contatore Geiger Mueller per monitorare regolarmente la contaminazione. L'isotopo radioattivo dell'azoto 13 viene prodotto in un ciclotrone e arriva come liquido per le misure di DI.

Utilizzando la pipetta di potassio 42, la quantità di soluzione madre radioattiva necessaria per raggiungere la concentrazione finale di potassio desiderata nella soluzione di marcatura Per le misure di DI, utilizzando l'azoto 13, pipettare una piccola quantità, meno di 0,5 millilitri di tracciante radio nella soluzione di marcatura. Lasciare che la soluzione di etichettatura si mescoli accuratamente tramite aerazione. Quindi, pipettare un sottocampione da un millilitro di soluzione di etichettatura in ciascuna delle quattro fiale di campione.

Misurare l'attività radio nelle fiale utilizzando un contatore gamma. Assicurarsi che il contatore sia programmato in modo tale che i conteggi al minuto o le letture CPM siano corrette. Per il decadimento isotopico, che è particolarmente importante per i traccianti a vita breve, calcolare l'attività specifica della soluzione di marcatura S non espressa in conteggi al minuto per micromole facendo la media dei conteggi dei quattro campioni e dividendo per la concentrazione del substrato in soluzione, immergere le radici dell'orzo in una soluzione di pre-marcatura non radioattiva per cinque minuti per preequilibrare le piante in condizioni di prova.

Successivamente, immergere le radici nella soluzione di marcatura radioattiva per cinque minuti. Trasferire le radici in una soluzione di desorbimento per cinque secondi per rimuovere la maggior parte dell'attività radio aderente alla superficie. Quindi trasferire le radici in un secondo becher di soluzione di desorbimento per cinque minuti.

Per eliminare ulteriormente le radici del tracciante extracellulare, sezionare e separare i germogli, i germogli basali e le radici. Posizionare le radici nelle provette da centrifuga e centrifugare i campioni per 30 secondi in una centrifuga di grado clinico a bassa velocità. Per rimuovere l'acqua superficiale e interstiziale, pesare le radici per ottenere il peso fresco.

Misurare la radioattività nei campioni di piante utilizzando un contatore di gamma, calcolare l'afflusso nella pianta utilizzando questa formula. Iniziare questa procedura preparando la soluzione di etichettatura e misurando il nodo S come mostrato in precedenza. Dopo aver misurato s, aggiungere 19 millilitri di acqua a ciascun campione in modo che il volume finale sia uguale al volume EIT di 20 millilitri.

Contare l'attività radio in ogni campione da 20 millilitri. Immergere le radici nella soluzione di etichettatura per un'ora. Dopo un'ora, rimuovere le piante dalla soluzione di etichettatura e trasferirle nell'imbuto FLX, assicurandosi che tutto il materiale radicale sia all'interno dell'imbuto.

Fissare delicatamente le piante al lato dell'imbuto di efflusso applicando una piccola striscia di nastro adesivo sul collare di plastica. Versare delicatamente il primo elu nell'imbuto. Avvia un timer per contare in secondi e, dopo 15 secondi, apri il rubinetto e raccogli l'EIT nella fiala campione. Chiudere il rubinetto, versare delicatamente l'EIT successivo nell'imbuto.

In questo modo, raccogliere l'EIT per il resto della serie Elucian per un periodo totale UE di 29,5 minuti. Una volta completato il protocollo UE, raccogliere le piante come mostrato in precedenza, contare l'attività radio negli EIT e nei campioni di piante utilizzando il contatore gamma, moltiplicando la lettura per ogni EIT per il fattore di diluizione che traccia il rilascio del tracciante in funzione del tempo di eluizione per condizioni di stato stazionario, eseguire regressioni lineari e calcoli dei flussi. Mezze bugie di scambio e dimensioni del pool.

Qui sono mostrate isoterme rappresentative per l'afflusso di ammoniaca in funzione delle diverse concentrazioni esterne di ammoniaca. Nelle radici intatte delle piantine d'orzo coltivate ad alto contenuto di ammoniaca o ammonio, e i flussi di ammoniaca a basso o alto potassio erano significativamente più alti a basso contenuto di potassio di McKayla. Le analisi delle isoterme con menina rivelano che l'alto contenuto di potassio ha un effetto relativamente limitato sull'affinità al substrato dei trasportatori di assorbimento dell'ammoniaca, ma riduce significativamente la capacità di trasporto.

Il risultato successivo evidenzia la rapida plasticità del sistema di assorbimento del potassio. Nelle radici di piantine di orzo intatte coltivate a potassio moderato e ammonio alto. Un aumento di quasi il 350% dell'afflusso di potassio è stato osservato entro cinque minuti dal ritiro dell'ammonio dalla soluzione esterna.

Questo effetto di prelievo di ammonio era sensibile ai bloccanti dei canali del potassio, il bario tetraetilammonio e il cesio. Questi grafici mostrano il potassio 42 efl allo stato stazionario nelle radici di piantine di orzo intatte coltivate a basso contenuto di potassio e nitrato moderato, e gli effetti immediati di 10 millimolari di cloruro di cesio, cinque millimolari di solfato di potassio e cinque millimolari di solfato di ammonio sul flx Il potassio flx è stato inibito dal cesio o dal potassio, ma stimolato dall'ammonio. Cate può anche essere utilizzato per stimare le concentrazioni e i tempi di turnover del substrato nei compartimenti subcellulari.

L'analisi di regressione della fase di lento scambio del rilascio del tracciante insieme alla ritenzione del tracciante nei tessuti vegetali può rivelare informazioni importanti sulle dimensioni del pool e sull'emivita di scambio di componenti subcellulari come la parete cellulare, il citoplasma e il va. Questa tabella mostra i parametri del mantello estratti dalle misurazioni del potassio 42 flx allo stato stazionario in piantine d'orzo coltivate con un millimolare di nitrato o 10 millimolari di ammonio. Quest'ultimo rappresenta uno scenario tossico.

L'alto contenuto di ammonio provoca la soppressione di tutti i flussi di potassio e un calo significativo delle dimensioni della piscina. Una volta padroneggiata, l'efficienza della metodologia DI può essere migliorata scaglionando i trattamenti a distanza di 30 secondi l'uno dall'altro. In tal modo, possiamo esaminare fino a 10 condizioni in un singolo esperimento.

Allo stesso modo, è possibile condurre più corse di Kate contemporaneamente con un tempo sufficiente tra le corse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i flussi di nutrienti e intossicanti nelle piante intatte utilizzando traccianti radioattivi.