Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury
3 agosto 2015
Qui presentiamo un metodo affidabile per studiare la rigenerazione renale adulta inducendo un danno renale acuto mediante iniezione di gentamicina. Dimostriamo che il danno dipende dal dosaggio di gentamicina e dalla temperatura ambientale utilizzando l'ibridazione in situ per marcare lhx1a+ sviluppando nuovi nefroni.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare pesci zebra adulti per studiare la rigenerazione renale. Ciò si ottiene iniettando la nefrotossina gentamicina nella cavità peritoneale del pesce per indurre una risposta acuta alla lesione. Successivamente, i pesci vengono alloggiati in vasche individuali durante la notte per l'osservazione.
Durante questo periodo, la formazione di calchi si verifica perché gli epiteliali del nefrone feriti vengono staccati e si raccolgono nel lume dei tubuli e delle anatre. I pesci feriti vengono identificati il giorno successivo in base alla formazione del getto e possono essere utilizzati in ulteriori esperimenti per studiare la rigenerazione renale. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che i pesci feriti espellono i calchi, che sono un noto indicatore di lesioni negli esseri umani.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente per l'iniezione di genamicina è che la formazione di CAS è un facile indicatore visivo di lesione. Dopo aver allevato pesci zebra adulti di età compresa tra sei e 12 mesi e aver preparato l'acqua di gentamicina e trica, secondo il protocollo di testo, ricavare una paletta di pesce da una pipetta di trasferimento di plastica tagliando il bulbo a forma di paletta e tagliando due fessure sul fondo per drenare l'acqua, caricare siringhe da un millilitro con la soluzione di gentamicina preparata e staccare un ago da 30 gauge e mezzo. Quindi rimuovere eventuali bolle d'aria e ruotare l'ago sulla siringa per assicurarsi che la punta della caviglia sia rivolta verso l'esterno e che i segni della siringa siano rivolti in avanti e leggibili.
Preparare piccoli contenitori da mezzo litro trasparenti con coperchi per contenere i pesci per l'osservazione durante la notte dopo l'iniezione e per osservare il getto epiteliale bianco versato dai pesci. Riempi ogni contenitore con abbastanza acqua per i pesci in modo che possano nuotare comodamente. Dopo aver anestetizzato un pesce secondo il protocollo di testo, utilizzare la paletta per pesci spostandosi dalla testa verso la coda per evitare di ferire le branchie o le pinne per raccogliere il pesce, posizionare il pesce su tovaglioli di carta per assorbire l'acqua in eccesso girandolo delicatamente su un lato e scuotendo l'acqua in eccesso dalla paletta.
Quindi, raccogli di nuovo il pesce e posizionalo sulla barca di strada sulla bilancia azzerata e pesa il pesce intorno a 0,25 grammi e calcola la quantità appropriata di Gentamicina da iniettare. Usa la paletta per raccogliere di nuovo il pesce e posizionarlo su un tovagliolo di carta piegato e asciutto. In caso di iniezione, usando la mano destra, tenere il tovagliolo di carta con la mano sinistra e posizionare la testa del pesce rivolta a sinistra con la pancia.
Facilmente raggiungibile. Se tenere fermo il pesce è un problema, stabilizzare i gomiti contro il busto. Quindi, tieni la siringa con l'ago a un angolo di 45 gradi rispetto alla pelle del ventre anteriore alla cloaca.
Spingi l'ago appena sotto la pelle, quindi diminuisci l'angolo e fai scorrere l'ago in avanti sotto la pelle, evitando gli organi interni. Premere lo stantuffo fino alla quantità appropriata e fare una pausa per assicurarsi che non fuoriesca liquido intorno all'ago. Prima di estrarre l'ago, lascia cadere il pesce in un contenitore individuale e assicurati che si riprenda dall'anestesia.
Mantieni il pesce a 28,5 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo l'iniezione, porre il pesce iniettato nel suo contenitore su una superficie scura. I calchi bianchi di tessuto epiteliale morto escreti dal pesce ferito dovrebbero essere visibili, mettere da parte il pesce e continuare a controllare gli altri pesci.
L'80-90% dei pesci iniettati dovrebbe produrre CAS se è stata iniettata una dose appropriata di gentamicina. Se non ci sono cas, o il pesce non è stato ferito dall'iniezione di gentamicina o il pesce è stato gravemente ferito, con conseguente blocco completo degli ureteri e del claco con i tessuti molli per prendersi cura del pesce in via di guarigione. Non tenere più di sei pesci per gruppo di trattamento per 500 millilitri di acqua dei pesci e cambiare l'acqua ogni giorno, se possibile, per mantenerla pulita.
Tre giorni dopo l'infortunio. Inizia a nutrire i pesci in piccole quantità una volta al giorno. Analizza i reni feriti secondo il protocollo di testo come visto qui, diversi dosaggi di gentamicina sono stati utilizzati per ferire il pesce zebra selvatico adulto di tipo due a b e sono stati confermati visivamente dall'osservazione di calchi epiteliali renali nell'acqua.
Un giorno dopo l'infortunio. Una bassa dose di gentamicina ha fatto sì che la maggior parte dei pesci non avesse lanci, mentre dosi più elevate hanno portato a oltre il 75% dei pesci che avevano lanci come dimostrato qui. Diversi dosaggi di gentamicina hanno portato a un aumento del numero di LHX uno di aggregati cellulari positivi nel rene rigenerante.
In questo esperimento, dopo l'infortunio con 80 milligrammi per chilogrammo di gentamicina, i pesci che hanno prodotto il cast sono stati divisi in due gruppi. Uno ha ricevuto un trattamento di shock termico di 37 gradi Celsius per 16 ore, e poi un periodo di riposo a 28,5 gradi Celsius ogni giorno. Come mostrato qui, lo shock termico da solo non induce una risposta alla lesione come osservato dalla densità degli aggregati LHX uno positivo.
Tuttavia, questo esempio illustra che lo shock termico ha accelerato la risposta nei pesci feriti rispetto all'assenza di controlli da shock termico entro sette giorni dall'infortunio, non c'era più una differenza significativa tra i gruppi feriti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ferire una superfic adulta con una nefrotossina e giudicare visivamente il loro livello di lesione in base alla formazione di CAS al fine di studiare la rigenerazione renale Dopo questa procedura. Altri metodi, come l'aggiunta di attivatori o inibitori delle vie di segnalazione, possono essere utilizzati per determinare quali segnali sono coinvolti nella risposta rigenerativa.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per lo studio della rigenerazione renale nell'adulto nei zebrafish, indotta da un danno renale acuto provocato tramite iniezione di gentamicina. La ricerca evidenzia la relazione tra il dosaggio della gentamicina, la temperatura ambientale e il processo di rigenerazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Rigenerativa
- Farmacologia
Sfondo
- La rigenerazione renale è un settore fondamentale di studio nella medicina rigenerativa.
- Il pesce zebra è un organismo modello grazie alle sue capacità rigenerative.
- La gentamicina è un nefrotossico in grado di indurre lesioni renali.
- Comprendere la risposta alla lesione può fornire informazioni sui meccanismi di rigenerazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per lo studio della rigenerazione renale nel pesce zebra adulto.
- Osservare gli effetti della gentamicina sul danno renale e sulla successiva rigenerazione.
- Esplorare la relazione tra fattori ambientali e gravità del danno renale.
Metodi Utilizzati
- Iniezione di gentamicina nella cavità peritoneale di zebrafish adulti.
- Allevamento dei pesci in vasche individuali per l'osservazione dopo l'iniezione.
- Monitoraggio della formazione di cilindri come indicatore di danno ai nefroni.
- Utilizzo dell'ibridazione in situ per etichettare i nefroni in via di sviluppo.
Risultati principali
- La gravità della lesione dipende dalla dose di gentamicina e dalla temperatura ambientale.
- La formazione di cilindri è stata osservata come indicatore affidabile di danno ai nefroni.
- Lo sviluppo di nuovi nefroni è stato etichettato con successo mediante ibridazione in situ.
- Il metodo fornisce una base per ulteriori studi sulla rigenerazione renale.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è efficace per lo studio della rigenerazione renale nel zebrafish.
- Il danno indotto da gentamicina può essere monitorato in modo affidabile attraverso la formazione di calchi.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi risultati per esplorare i meccanismi di rigenerazione renale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente un danno renale indotto da nefrotossine riproducibile nei zebrafish adulti, fornendo un modello scalabile per lo studio dei meccanismi di rigenerazione renale. La valutazione del danno basata su osservazione visiva supporta lo screening ad alto rendimento di composti o modificatori genetici che influenzano le vie di riparazione. Tali modelli migliorano la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nei programmi preclinici di nefrotossicologia e medicina rigenerativa.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche nella rigenerazione renale inducendo un danno controllato e quantificabile mediante somministrazione di gentamicina.
- Valore operativo: Fornisce un modello di danno riproducibile per valutare la riduzione del rischio biologico di bersagli coinvolti nell'attivazione dei progenitori nefronici o nella riparazione tubulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera modelli di lesione con aggregati di progenitori positivi per LHX1a dipendenti dalla dose, consentendo letture quantitative per la modulazione del percorso.
- Valore operativo: Utilizza uno screening visivo non invasivo mediante impronta per standardizzare la gravità della lesione tra diverse popolazioni, migliorando la riproducibilità del saggio nei test su composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta lo studio di sistemi rilevanti per le malattie modellando il danno renale acuto e la rigenerazione, in linea con la scoperta di biomarcatori traslazionali nel ripristino renale.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo analisi longitudinali della cinetica rigenerativa in condizioni variabili come la temperatura.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo saggio si inserisce nel percorso dalla biologia della scoperta all'identificazione dei composti attivi, fornendo una piattaforma renale rigenerativa per valutare i modificatori delle vie di riparazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle dinamiche dei progenitori dei nefroni e sui percorsi di risposta al danno attraverso modelli standardizzati indotti da gentamicina.
- Screening: Permette la prontezza del saggio grazie alla formazione visibile di cast come biomarcatore quantitativo del danno, utilizzabile per input in schermate di composti o genetiche.
- Analisi: Fornisce letture di immunoeistochemia per LHX1a per misurare l'attivazione dei progenitori e la neogenesi dei nefroni come output funzionali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando cicli di danno e rigenerazione rilevanti per i processi di riparazione della lesione renale acuta nell'uomo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per test iterativi di modulatori di percorsi in più team di progetto che studiano la rigenerazione renale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi collegando l'attivazione dei progenitori a risultati funzionali di rigenerazione.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso la valutazione della lesione dose-dipendente e il controllo ambientale.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione riducendo l'ambiguità nei percorsi meccanicistici che regolano la riparazione renale.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi degli obiettivi di rigenerazione in base alla cinetica di rigenerazione dipendente dalla dose e dalla temperatura.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allevamento dei zebrafish, microiniezioni e protocolli di anestesia.
- Presuppone l'accesso a microscopia a fluorescenza o immunohistochimica per il rilevamento di LHX1a.
- Necessita di condizioni standardizzate di allevamento e controllo della qualità dell'acqua per ottenere risultati riproducibili riguardo all'insulto e alla rigenerazione.
- Richiede considerazioni di adattamento per applicare i modelli di lesione a diverse linee di zebrafish o a gruppi di età differenti.
- È limitato dalla necessità di un monitoraggio postoperatorio per distinguere lesioni subletali da quelle letali, in base alla formazione del coagulo e alla sopravvivenza.
