Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la progressione delle cellule mammarie dopo l'attecchimento delle cellule tumorali nel cuscinetto adiposo della memoria del topo. Ciò si ottiene iniettando cellule di cancro al seno nel cuscinetto adiposo di memoria di un topo adulto e quindi misurando il volume del tumore con un calibro a livelli di tempo predeterminati. Alla fine dell'esperimento, sono stati determinati la massa e il volume del tumore e il sangue e i polmoni dell'animale sono stati raccolti per ulteriori analisi.

In definitiva, le macro e micro metastasi possono essere quantificate rispettivamente mediante analisi visiva e immunoistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'iniezione sottocutanea di cellule tumorali, è che il sito di iniezione del cuscinetto adiposo mammario imita il sito originale di formazione del tumore al seno, producendo risultati più affidabili. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro al seno, come ad esempio quali tumori, soppressori, oncogeni o componenti del compartimento stromale sono coinvolti nella progressione del cancro.

Un giorno prima della procedura, radere i topi gamma N-O-D-S-C-I-D dal quarto capezzolo alla linea mediana e pesarli per verificare che tutti gli animali abbiano pesi approssimativamente comparabili. Il giorno successivo, lavare una coltura cellulare di adenocarcinoma mammario umano una volta con PBS e poi provare a anizzare le cellule quando la maggior parte delle cellule si è staccata. Spegnere la reazione con 10 millilitri di siero contenente terreni DMEM e quindi centrifugare le cellule per sette minuti a 1.200 RPM a temperatura ambiente, lavare il pellet per rimuovere ogni traccia di siero e quindi risospendere il secondo pellet in PBS.

Dopo il conteggio, aliquotare le cellule in concentrazioni di 500.000 per 150 microlitri in provette sterili per microcentrifuga su ghiaccio. Quindi riempire una provetta conica da 50 millilitri con 35 millilitri di PBS e un'altra con etanolo al 70% e immergere i tamponi di cotone in ciascuna. Quando tutti gli strumenti sono pronti per ogni animale, applica un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale.

Quindi utilizzare del nastro adesivo per trattenere delicatamente un mouse anestetizzante su un termoforo e confermare la sedazione con un pizzico di punta. Usa un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo per pulire l'area rasata e poi usa una lama di bisturi per praticare una piccola incisione tra il quarto capezzolo e la linea mediana. Inserisci il batuffolo di cotone imbevuto di PBS nell'incisione per fare una tasca e poi usa una pinzetta per esporre un cuscinetto di grasso di memoria, che può essere rilevato dal suo colore bianco.

Usa un altro paio di pinzette per spremere il cuscinetto adiposo alla base ed esporre completamente il tessuto. Quindi pipettare le cellule dell'adenocarcinoma su e giù alcune volte per ottenere una soluzione cellulare omogenea e aspirare delicatamente 150 microlitri di cellule in una siringa da insulina. Facendo attenzione a tenere una siringa orizzontalmente con il foro dell'ago rivolto verso l'alto.

Iniettare le cellule nel cuscinetto adiposo mammario confermando il successo dell'iniezione mediante gonfiore del tessuto. Quindi rilascia delicatamente il cuscinetto adiposo e usa una pinza per zanzare per suturare l'incisione, ruotando la sutura attorno alla pinza per zanzare in senso orario, antiorario e orario per fare tre nodi. Dopo l'intervento chirurgico, iniettare un analgesico e posizionare ogni animale in posizione sdraiata sternale in una gabbia individuale, monitorando i topi fino a quando non si sono completamente ripresi.

Otto settimane dopo l'impianto delle cellule, i topi vengono preparati per il prelievo di organi. Fissare l'animale a una base di schiuma e utilizzare dei calibri per misurare il volume del tumore. Quindi, fai una lunga incisione verticale sulla linea mediana e poi fai due incisioni orizzontali proprio sotto la gamba anteriore e sopra la gamba posteriore.

Appunta la pelle alla schiuma per esporre il tumore, quindi usa le forbici per dissociare il tumore dalla pelle. Quindi rimuovere delicatamente i polmoni, inserendo il polmone sinistro nella soluzione di Bowen per tre giorni, dopodiché questo folky metastatico superficiale diventerà chiaramente visibile ad occhio nudo, congelerà parte del tessuto in azoto liquido per un successivo isolamento dell'RNA e posizionerà la parte rimanente del tumore in uno dei tubi conici riempiti di formina. Successivamente, dopo il sacrificio dell'animale mediante puntura cardiaca, ha dispensato il campione di sangue da 450 microlitri in una provetta da microcentrifuga contenente 50 microlitri di citrato di sodio al 3,2%, quindi ha centrifugato i globuli rossi e conservato i campioni di plasma a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Errori sperimentali come un'inoculazione imprecisa delle cellule o perdite possono portare a variazioni nelle dimensioni del tumore o addirittura all'assenza di un tumore che porta a la formazione di una struttura che appare simile alla memoria.

Cuscinetto adiposo iniettato con tampone di controllo. Il tasso di crescita del tumore dipende anche dalla natura della linea cellulare iniettata e in generale può essere osservato attraverso la pelle del topo. Inoltre, l'area intorno al tumore può mostrare grandi vasi che derivano dal rimodellamento vascolare e che possono svolgere un ruolo cruciale nella rimozione dei prodotti di scarto e nell'approvvigionamento del tessuto tumorale di nutrienti e ossigeno.

A differenza degli esperimenti in vitro, il tasso di crescita delle cellule tumorali potrebbe non essere costante nel tempo in vivo a causa dell'ipossia e della mancanza di nutrienti. Aree necrotiche possono formarsi all'interno del tessuto circostante e queste aree influenzeranno il tasso di crescita del tumore. Inoltre, le cellule iniettate che esprimono specifici geni di interesse possono influire sulla progressione del cancro poiché i geni possono indurre una crescita tumorale che inizia rapidamente, ma rallenta alla fine o viceversa.

La raccolta dei polmoni nella soluzione di Bowen aiuta a visualizzare i focolai metastatici superficiali, che appaiono come formazioni pallide in rilievo sulla superficie del tessuto polmonare. La formazione dei focolai dipende dalla linea cellulare. Le cellule non aggressive possono dare origine solo a micro metastasi, che possono essere facilmente identificate con la colorazione h ed e sul tessuto polmonare incluso in paraffina.

Seguendo questa procedura, altri metodi come Eliza possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio in che modo la crescita del tumore sperimentale influisce sui livelli di citochine o molecole pro-angiogeniche nel plasma.