Name: Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Impara a creare modelli ortotopici di tumori cerebrali umani in topi mediante iniezione intracranica precisa. Questa tecnica consente di testare nuove strategie terapeutiche con elevata riproducibilità e validità istopatologica.

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Il dottor Keating è finanziato da DOD CA100335 concessione ed è un San Baldrick Foundation Scholar.

Tutte le procedure descritte sono stati esaminati e approvati dal nostro cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale. 1 Piano Experiment <ol><li> Scegli le cellule da iniettare. Le cellule provenienti da una varietà di fonti sono candidati per l&#39;iniezione: aderenti linee di coltura cellulare, cloni geneticamente modificati, cellule neurosfere, colture primarie, o tumori disaggregati. Il tipo di modello desiderato definirà la sede più idonea di iniezione. <ol><li> Determinare il numero di cellule per l&#39;iniezione. Il numero di cellule necessario per formare tumori varia con la linea cellulare e deve essere determinato empiricamente; tasso di crescita tumorale dipende fortemente dal tipo di cellulare, numero di cellulare e numero di colture di tessuti passaggio. Numeri di cellulari che vanno da 1 x Ottobre 04-2 x 10 5 o più per iniezione hanno prodotto tumori di varie tassi di crescita. </li><li> Limitare il volume per l&#39;iniezione. Le cellule devono essere sospese nel più piccolo volume di siero media liberi o fosfato tamponata sAline (PBS) che permette di regolare, facile passaggio attraverso un ago 26 G. Il più piccolo il volume effettivamente consegnato nel cervello, il più preciso e definito il tumore risultante; Risultati ottimali si ottengono iniettando volumi che variano da 3 a 6 microlitri. Piano di preparare un volume totale finale di almeno 50 ml di cellule in sospensione, indipendentemente dal numero di iniezioni pianificate, per consentire misurazioni accurate, miscelazione e campionamento. </li></ol></li><li> Scegli topi appropriato per il modello. Modelli murini di tumori umani in genere utilizzano giovani topi immuno-compromessi per evitare rigetto immunitario mediata. Non è necessario per il lavoro che si terrà in una cappa di sicurezza biologica se vengono prese precauzioni appropriate, compresa la decontaminazione, disinfezione e sterilizzazione di materiali e attrezzature. Il lavoro qui mostrato è stato fatto in topi nudi atimici, maschi e femmine, tra i 6 e 12 settimane di età. I topi che pesano meno di 20 g può essere difficile da posizionare cometelaio tereotaxic e può essere più suscettibile di ipotermia. </li></ol> 2 Montare l&#39;apparecchiatura <ol><li> Ottenere e decontaminare un mouse telaio stereotassico, console di allineamento, e porta la testa anestesia gas del mouse, pompa microsiringa, rilievo di calore, macchina per anestesia, lampada da lavoro in fibra ottica, e trapano rotante a velocità variabile. Pulire e decontaminare tutte le attrezzature. </li><li> Programmare i parametri di iniezione (tra cui il volume di iniezione, la portata, unità di tasso, tipo siringa) e altre variabili necessarie per il funzionamento della pompa a siringa. Ottimizzare le impostazioni per ogni modello particolare. NOTA: In queste iniezioni le impostazioni erano 3.000 campioni nl ad una velocità di 400 nl / min (unità di tasso &quot;M&quot;) utilizzando una siringa da 25 ml (Device Type &quot;E&quot;), modalità nel Non-raggruppati (&quot;N&quot;). </li><li> Pulire una microsiringa di precisione con il 26 ago G con diversi risciacqui di acqua deionizzata sterile (diH 2 O) e il 70% di etanolo (EtOH), facendo un ri finalense con diH 2 O. Alcuni, ma non tutti i modelli sono progettati per essere sterilizzati in autoclave. Accertarsi che il movimento del pistone è liscia e libera. </li><li> Ottenere apparecchiature per anestesia. Isoflurano è l&#39;anestetico preferito in quanto è facile da regolare la profondità e la durata dell&#39;anestesia. Assicurarsi che l&#39;unità stereotassica è dotata di un attacco di gas per anestesia del mouse e che il tubo e connettori necessari sono in atto per fornire la miscela di gas dalla macchina per anestesia al mouse. </li><li> Strumenti chirurgici Autoclave, tra cui forbici a punta fine, due pinze / pinze emostatiche (con denti) per sutura, forbici di medie dimensioni, pinzette medio e punta fine, e almeno due punte dentali 1 mm. Mantenere gli strumenti puliti durante la procedura con il 70% EtOH, disinfettante, o uno sterilizzatore tallone. </li><li> Ottenere isoflurano, analgesico, unguento oftalmico / lubrificante, pomata antibiotica, soluzione salina, il 30% di perossido di idrogeno (H 2 O 2), antisettico, e cera ossea (se desiderato) da unfornitura veterinario o medico. Preparare sterile diH 2 O e il 70% EtOH. Usa e getta, come garze, medicazioni sterili, suture, tamponi di cotone, etanolo punta tamponi, guanti chirurgici sterili, lame chirurgiche e più sono dettagliate nella lista dei materiali. Un bel pennarello indelebile punta per la marcatura del cranio deve essere decontaminata e dedicato per uso chirurgico. </li></ol> 3 Preparare Celle per iniezione <ol><li> Negli esperimenti qui riportati, selezionare una linea di cellule GBM umano immortalato. Determinare il numero di cellule (2 x 10 5) e il volume di sospensione da iniettare (3 ml) empiricamente; dettagli possono variare con il tipo di cellule. Usare un volume di almeno 50 ml di facilitare misurazione accurata, miscelazione e iniezione. </li><li> Trypsinize cellule e risospendere in media o PBS. Effettuare le seguenti operazioni appena prima dell&#39;iniezione di cellule: <ol><li> Rimuovere i supporti dalle cellule mediante aspirazione e lavare con 10 ml di PBS per mm piastra 100; rimuovi PBS. </li><li> Annunciod 1 ml di tripsina per ogni piastra mm 100 e incubare a RT giusto il tempo di produrre una sospensione di cellule singole. </li><li> Interrompere l&#39;attività di tripsina con 5 ml di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) + 10% di siero fetale bovino (FBS) per mm piastra 100. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 450 xg e risospendere in ~ 5 ml di siero DMEM libero (SF-DMEM) per mm piastra 100. </li><li> Contare cellule vitali mediante un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. </li><li> Regolare la densità delle cellule dal vivo per 2 x 10 5 cellule / 3 ml (o come determinato da sperimentazione) di pellet e risospendere le cellule in SF-DMEM. </li></ol></li><li> Mantenere le cellule refrigerate su ghiaccio o una confezione freddo (non consentono alle cellule di congelare). Mescolare delicatamente schioccare le dita. </li></ol> 4. Anestetizzare e Preparare il mouse per Chirurgia <ol><li> Indurre l&#39;anestesia utilizzando ~ 5% isoflurano (ossigeno flusso ~ 2 L / min) o come indicato dal veterinario. Induzione dovrebbe prendere 2 a 3 min. Mantenere il mouse ad una profondità adeguatadi anestesia con ~ 3% isoflurano. <ol><li> Controllare la profondità di anestesia pizzico punta, regolare isoflurano se indicato e continuare a monitorare la respirazione e la punta risposta pizzico tutta la procedura. Coprire mouse con garze per calore e controllare il mouse regolarmente durante tutta la procedura, che può richiedere 45 minuti a 1 ora, a seconda del tasso di iniezione. </li></ol></li><li> Posizionare il mouse nel telaio stereotassico trascinando con attenzione la barra palato sulla lingua e nella bocca. Agganciare gli incisivi anteriori nel foro del dente. Utilizzare barre orecchio per stabilizzare la testa, con la superficie orecchio-a-occhio il più vicino possibile orizzontale. Non forzare bar nel condotto uditivo. E &#39;fondamentale per posizionare la testina in modo sicuro: controllare il movimento da lato a lato e su-e-giù delicatamente con i polpastrelli. Utilizzare i controlli di regolazione dell&#39;unità stereotassico per ottimizzare vestibilità. </li><li> Lubrificare gli occhi con pomata oftalmica. Pulire la pelle tra le orecchie e gli occhi due volte con alternanza di applicazioni di un povidone-iodine antisettico e il 70% EtOH. </li><li> Iniettare per via sottocutanea analgesico scelto (SQ) in fianco (o come indicato). </li></ol> 5 Eseguire iniezione <ol><li> Determinare il sito di iniezione. Il sito di iniezione può variare con le dimensioni e la tensione del mouse e il tipo di cellula. Cellule iniettate troppo vicino ai ventricoli possono portare alla diffusione cranio-spinale della malattia. Cellule iniettate troppo superficiale possono crescere attraverso il percorso dell&#39;ago. NOTA: Negli esperimenti qui riportati, l&#39;obiettivo è stato definito come la regione frontale della corteccia cerebrale un sito 2,5 millimetri laterale (destra) 1,5 mm anteriormente e 3,5 mm ventrale rispetto al bregma è stato scelto (Figura 1), producendo un tumore mesencefalo nei topi che vanno da 20 a 30 g. </li><li> Fai una piccola incisione (~ lunga 8 mm) con tecnica sterile attraverso la pelle della testa per esporre il bregma e il sito di iniezione. Un taglio diagonale, da un punto tra l&#39;asse mediana e l&#39;occhio destro verso l&#39;orecchio destro ( <strong&gt; Figura 2) consente l&#39;accesso sia al bregma e il sito di iniezione. </li><li> Ritrarre la pelle e utilizzare un tampone di cotone sterile per asciugare la superficie del cranio. Tamponare l&#39;osso con un altro tampone inumidito con H 2 O 2 per visualizzare bregma. L&#39;H 2 O 2 produrrà bolle di ossigeno, lasciando le linee sottili di schiuma bianca lungo le suture coronali e sagittali che si intersecano al bregma. </li><li> Bloccare una siringa vuota con ago sulla micropompa e manovrare la punta dell&#39;ago direttamente sopra il bregma; set di coordinate sulla console di allineamento a 0,0 mm lateralmente, 0,0 millimetri anteriore / posteriore e 0,0 millimetri ventrale / dorsale. </li><li> Spostare l&#39;ago a 2,5 mm lateralmente (destra) ea 1,5 mm anteriormente rispetto al bregma (o posizione desiderata) utilizzando le manopole di controllo sull&#39;unità stereotassico. Sollevare la siringa leggermente e segnare la posizione esatta sul cranio con un pennarello apposito. Se la superficie esterna del cranio non è in piano con bregma (i.e., la dorsale / ventrale coordinate non più legge zero), ripristinare il ventrale / dorsale a leggere per 0,0 al fine di garantire che la profondità della iniezione non viene spostato. </li><li> Praticare un piccolo foro nel cranio con un trapano rotativo portatile dotato di una punta sterile dentale presso il sito appropriato contrassegnati con la penna al punto 5.5. Tenere il trapano in un angolo al cranio e toccare molto delicatamente la punta all&#39;osso. Ripetere se necessario. Foratura quasi ma non completamente attraverso l&#39;osso, lasciando l&#39;ago per penetrare effettivamente questo strato del cranio, comporta l&#39;iniezione pulito. </li><li> Rimuovere la polvere di osso con un batuffolo di cotone inumidito in PBS o soluzione salina. Ritorna la siringa alla pompa e abbassare l&#39;ago verso il basso per il buco bava per confermare la posizione. Se il buco bava non è centrato con l&#39;ago, usare il trapano per allargare l&#39;apertura. </li><li> Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e disegnare le celle nella siringa utilizzando il controller della pompa. Evitare bolle e grumi e pulire l&#39;arguzia agoh un tampone imbevuto di alcool per rimuovere le cellule contaminanti sulla superficie esterna. Se la siringa / ago è ostruito o congelato, rimuovere e pulire subito con acqua sterile e il 70% EtOH. </li><li> Abbassare l&#39;ago al livello della superficie del cranio (0,0 millimetri ventrale / dorsali). Poi, lentamente (in circa 1 min) abbassare l&#39;ago per perforare attraverso l&#39;intero spessore del cranio e penetrare il cervello ad una profondità di quattro millimetri ventrall. Estrarre l&#39;ago lentamente a 3,5 mm ventrale. Se la testa del mouse viene tenuto saldamente nell&#39;unità stereotassico, ci dovrebbe essere quasi nessun movimento del cranio. </li><li> Verificare che i parametri corretti nel controller della pompa (sezione 2.2) e premere il tasto &quot;RUN / STOP&quot; (o come indicato dal manuale del prodotto) per autoinject cellule. Monitorare il mouse e regolare isoflurano se indicato. Guarda la siringa e verificare che il pistone si muove in canna. Movimento congelato o intasato può risultare in un piegato / pistone rotto. </li><li> Attendere da 1 a 2 min con l&#39;ago in bpioggia, poi molto lentamente (più di 3 a 4 min) ritirare l&#39;ago dal tessuto. Tempo totale per rimuovere l&#39;ago dopo l&#39;iniezione è completa si trova a 5 min. Usare un tampone di cotone per asciugare la zona intorno al foro bava; lasciare i bordi della pelle aperta per consentire l&#39;osso asciugare. </li><li> Togliere la siringa dalla pompa e sciacquare rapidamente 3x con H 2 O sterile, 3x con il 70% EtOH, e 3 volte con H 2 O sterile (o come indicato dal produttore). Pulire ago con EtOH e mettere da parte. </li><li> Applicare la cera ossea sterile (equivalente a 1 o 2 ml) al foro bava e utilizzare l&#39;estremità di legno di un tampone di cotone sterile per tamp la cera sopra e nell&#39;osso. Se la superficie viene essiccato adeguatamente, dovrebbe attaccare. </li><li> Stendere telo sterile su tutta l&#39;area di lavoro del mouse e dintorni e suturare l&#39;incisione; tre punti dovrebbero essere sufficienti. In alternativa, è possibile utilizzare l&#39;adesivo chirurgico. Applicare un antibiotico topico. </li><li> Ridurre isoflurano al 0% e rimuovere il mouse dall&#39;unità stereotassico, essendo careful per proteggere i denti. Controllare le orecchie, la bocca e la lingua. </li><li> Monitorare il mouse vicino dopo l&#39;iniezione. Posizionare il mouse su un rilievo di calore per 5 a 10 minuti; poi il trasferimento a gabbia (il rilievo di calore) e osservare il mouse fino a quando si sveglia ed è ambulatoriale. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando non ha ripreso coscienza sufficiente per mantenere prona sternale. Non restituire mouse per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Considerare l&#39;uso di analgesici supplementari se i segni di dolore sono notati. </li></ol> 6 Fine e Monitor Recovery e lo sviluppo del tumore <ol><li> Pulire tutti gli strumenti e le attrezzature che utilizzano il 70% EtOH, uno sterilizzatore perlina o disinfettante tra i topi. </li><li> Monitorare i topi iniettati per due giorni dopo la procedura per i segni di dolore, infezioni o altre complicazioni. Iniettare analgesico a 24 e 48 ore (o come indicato) dopo la procedura. Rimuovere suture a 7 a 10 giorni, se necessario. </li><li> Valutare i topi per i segni clinici della malattia, paralysis, diminuzione dell&#39;attività, perdita di peso, convulsioni, o malattia generale. </li><li> Monitorare lo sviluppo del tumore con i mezzi adeguati [risonanza magnetica (MRI), in vivo Imaging Systems (IVIS), ecc]. </li></ol>

<ol><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).</li>
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<li>Brooks, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+and+efficient+murine+CNS+gene+delivery+using+a+microprocessor-controlled+injector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector.</a> Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).</li>
<li>Shankavaram, U. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+indicates+orthotopic+xenograft+of+glioma+cell+lines+simulate+a+subclass+of+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).</li>
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<li>Thaci, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+study+of+neural+stem+cell-based+cell+carrier+for+oncolytic+virotherapy%3A+targeted+delivery+of+the+therapeutic+payload+in+an+orthotopic+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model.</a> Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+orthotopic+glioma+xenografts+recapitulate+infiltrative+growth+and+isocitrate+dehydrogenase+I+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation.</a> J. Vis. Exp. (83), (2014).</li>
<li>Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>Iwami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+intracranial+injection+via+the+postglenoid+foramen+for+brain+tumor+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models.</a> Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Modelli di mouse ortotopico di cancro al cervello umano può essere un ottimo strumento per valutare l&#39;efficacia delle terapie cliniche, ma la cura deve essere presa per ottimizzare il posizionamento delle cellule nel tessuto cerebrale. Studi hanno dimostrato che eccessivi volumi aliquote, tecnica di iniezione ottimale e tassi di iniezione affrettate possono portare a mancanza di tenuta e la comparsa di cellule tumorali in luoghi indesiderati (ventricoli, midollo spinale, regioni extradurali, ecc.) E alta va...

Studi in vitro su cellule tumorali del cervello sono di valore inestimabile per sezionare i meccanismi molecolari che guidano la crescita, la sopravvivenza, la migrazione e l&#39;invasione delle cellule tumorali; esperimenti sulle cellule in coltura possono definire vie di segnalazione, suggerire potenziali bersagli terapeutici, e caratterizzare la risposta cellulare al trattamento farmacologico. Ma in vitro sistemi sono troppo semplicistico per predire la risposta ai farmaci organismal; mancano le reazioni fisiologiche, le risposte immunitarie, microambiente cellulare, e eterogeneità complessiva dei sistemi viventi animali. Geneticamente modelli di ingegneria può essere prezioso, quando disponibile, ma esistono differenze molecolari tra le specie e le cellule murine non può ricapitolare gli eventi in processi umani, con conseguente discrepanze significative quando si confrontano modelli animali di osservazioni cliniche 1. Modelli di xenotrapianto topi, che comporta sottocutanea (SQ) iniezione di linee cellulari tumorali del cervello umano sotto la pelle del fianco sono facili da eseguiree misurare; essi possono essere usati per affrontare gli effetti di modificazione genica e la somministrazione del farmaco / consegna, metabolismo e tossicità. Inconvenienti di rilievo, tuttavia, limitano l&#39;utilità dei modelli SQ. Il microambiente non ricapitolare quello di un tumore cerebrale naturale: le interazioni dei vari tipi di cellule e tessuti; la vascolarizzazione locale, e una miriade di altri fattori unica per il cervello non possono essere replicati. Per riprodurre in modo più accurato l&#39;ambiente unico di un tumore al cervello naturale e testare gli effetti degli interventi farmaceutiche, un modello ortotopico mouse dovrebbe essere utilizzato. Inoltre, le tecniche di ortotopici può essere utilizzato come parte di un approccio geneticamente in cui le cellule non cancerose umane primarie (differenziate o progenitore) sono geneticamente modificati e iniettato nel sito in questione di un mouse, con o senza cellule dello stroma umane, con conseguente tumorigenesi simile a quello osservato negli esseri umani 1. Questo articolo descriveuna metodologia per creare con precisione e riproducibile tumori cerebrali nei topi. Usando questa tecnica, l&#39;utente può iniettare con precisione una piccola aliquota di cellule sospese in una posizione specificata della regione fronto-parieto-temporale del mouse corteccia cerebrale. Mortalità del mouse è estremamente basso; nelle nostre mani, non i topi sono morti per complicazioni chirurgiche dopo 185 procedure. Caratteristiche del tumore risultante può essere confrontato con quello dei tumori clinici tipici; per esempio: rapidità di crescita, il grado di necrosi, estensione dell&#39;invasione, eterogeneità di tipo cellulare, la presenza di cellule mitotiche, marcatori di proliferazione e apoptosi, ecc linee cellulari e campioni di tessuto o disaggregati tumorali umane possono quindi essere valutati in base alla loro capacità di per simulare la presentazione clinica reale. Pharmaceuticals, selezionati in base alle loro performance in coltura cellulare, possono essere testati nel contesto di un metabolismo funzionante, sistema circolatorio, e la barriera emato-encefalica, come esistono in un animale gravato witah tumore, il tutto in un contesto architettonico rilevante. Inoltre, le cellule scelti per l&#39;iniezione possono essere geneticamente modificati per studiare l&#39;impatto di atterramenti specifiche, delezioni, knock-in, le mutazioni, ecc sulla crescita del tumore e la sopravvivenza. Un certo numero di pubblicazioni documentano tumori studi che utilizzano una varietà di tecniche intracraniche. Yamada et al. Ha fatto uno studio dettagliato della iniezione di colorante e di cellule U87 e ha scoperto che riducendo al minimo il volume di iniezione e la tariffa prodotto il migliore tumore 2. . Brooks et al trovato riproducibilità superiore e l&#39;efficienza mediante un iniettore controllato da microprocessore piuttosto che un metodo manuale per fornire vettori virali; le loro conclusioni in materia di parametri di iniezione ottimali sono applicabili alla consegna delle cellule 3. Shankavaram et al. Hanno dimostrato che glioblastoma multiforme (GBM) linee di cellule iniettate ortotopicamente (utilizzando un metodo manuale) nel cervello ricapitolato il profilo di espressione genica del cltumori inical più strettamente che sia in xenotrapianti vitro o SQ, sostenendo l&#39;utilizzo di modelli intracranici per gli studi preclinici 4. Giannini et al. Cellule da campioni chirurgici umani che erano stati sostenuti nei fianchi di topi nudi da passaging seriale nel cervello di topi ulteriori iniettato, e ha dimostrato che questo approccio conservato paziente alterazioni del gene del tumore nel modello 5. Risultati simili sono stati riportati da Yi et al 6. Utilizzando una configurazione stereotassico, sito di iniezione ben definita, e una velocità di iniezione lento e costante, ottennero tumori cerebrali riproducibili con tassi di crescita costanti e alto (100%), tasso di attecchimento. La validità di questa tecnica è stato quindi ben definito; una ricerca di letteratura suggerisce che le applicazioni di questa tecnica sono ampie. Carty et al. Usato iniezioni intracraniche di consegnare con successo vettori virali esprimenti geni terapeutici nella corteccia frontale di transgenic modello della malattia di Alzheimer 7. Thaci et al. Ha descritto l&#39;uso di iniezioni intracraniche di consegnare terapeutico adenovirus oncolitici in un supporto a base neurale delle cellule staminali in topi nudi già trasportano ortotopicamente iniettati tumori GBM 8. Chiaramente, le iniezioni intracraniche sono uno strumento versatile ed efficace per la ricerca preclinica. Pubblicazioni precedenti in The Journal of Experiments Visualizzato descrivono approcci fondamentali 9-11, ma prendiamo il concetto di iniezione intracranica del tumore e la modellazione ortotopico a un livello superiore di precisione utilizzando la tecnologia facile da padrone.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Strumento stereotassico per piccoli animali con console di visualizzazione digitale</td><td>Kopf</td><td>Modello 940</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per testa per anestesia a gas per topo</td><td>Kopf</td><td>Modello 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Barre auricolari</td><td>per mouse Kopf</td><td>Medel 922</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore a fibre ottiche</td><td>Fisher</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Microprocessore</td><td>WPI</td><td>UMC4</td><td></td></tr><tr><td>Trapano rotativo manuale a velocità variabile</td><td>Dremel</td><td>Modello 300</td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano dentale, 1,0 mm</td><td>Spoelting</td><td>514554</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per punta da trapano dentale: pinza da 3/32 di pollice</td><td>Dremel</td><td>481</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetto</td><td></td><td></td> riscaldante <td>per mouse</td></tr><tr>Sistema <td></td><td></td><td>di vaporizzazione isoflurano</td><td>per topi</td></tr><tr><td>Tubi medici e connettori</td><td></td><td></td><td>per collegare il vaporizzatore isoflurano con telaio</td></tr><tr> stereotassico<td colspan="4">Instruments</td></tr><tr><td>Precision 25 &mu; l microsiringa</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>Modello 702, senza ago</td></tr><tr><td>Aghi per microsiringhe, 26s G</td><td>Hamilton</td><td>7804-04</td><td>RN, 25 mm con punta 2</td></tr><tr><td>Forbici a punta fine (dritte, affilate/affilate)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td>standard di medie dimensioni</tr><tr><td>Pinze</td><td></td><td></td><td></td>seghettate standard</tr><tr><td>Emostatici seghettati (2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td></td><td></td><td></td> a punta fine</tr><tr><td colspan="4">Supplies</td></tr><tr><td>Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)</td><td>MWI</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgiche #10, inossidabili (Feather)</td><td>Fisher</td><td>296#10</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Fluriso)&nbsp;</td><td>VetOne&nbsp;</td><td>NDC 13985-528-60</td><td>Articolo #502017. Anestetico per inalazione di liquidi. La legge federale limita l'uso di questo farmaco da parte o su prescrizione di un veterinario autorizzato.</td></tr><tr><td>Carprofene (Rimadyl iniettabile 50 mg/ml)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 61106-8507-01</td><td>diluito in soluzione salina</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico (lacrime artificiali)</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico topico (AK-Poly-Bac)</td> <td>Akorn</td><td>NDC 17478-238-35</td><td></td></tr><tr><td>Antisettico topico povidone-iodio, 10% (Betadine)</td><td>Betadine</td><td>NDC 67618-150-04</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno, 30%</td><td>Pescatore&nbsp;</td><td>H325-100</td><td>per la visualizzazione dei punti di riferimento del cranio</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile</td><td>VetOne&nbsp; &nbsp;</td><td>NDC 13985-807-25</td><td>per soluzioni di diluizione, pulizia dei tessuti</td></tr><tr><td>Cera ossea</td><td>WPI</td><td>Articolo #501771</td><td></td></tr><tr><td>Teli sterili</td><td>McKesson</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Guanti chirurgici sterili</td><td>McKesson</td> <td>(da adattare)</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di garza sterili, 2 x 2</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td></td><td></td>22028556</tr><tr><td>Garze sterili, 4 x 4</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol (medi)</td><td>PDI</td><td>B603</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori sterili con punta in cotone Fisherbrand</td><td>&nbsp;</td><td>23-400-114</td><td></td></tr><tr><td>Tubo sterile da 0,5 ml con tappo a vite con tappi per cellule</td><td>USA Scientific</td><td>1405-4700</td><td>per cellule</td></tr><tr><td>Pipette sterili confezionate singolarmente Fisher</td><td></td><td>BD 357575</td><td>per soluzioni per la pulizia degli aghi</td></tr><tr><td>Siringhe da insulina BD con aghi&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>329461</td><td>per analgesico</td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td></td><td></td><td>per la pulizia</td></tr><tr><td>Sterile diH2O</td><td></td><td></td><td>per la pulizia</td></tr><tr><td>Tubi in microfugo per soluzioni</td><td></td><td></td> detergenti <td>per soluzioni per la pulizia dell'ago</td></tr><tr><td>Pennarello con punta in feltro (dedicato)</td><td></td><td></td> <td>per la marcatura del cranio</td></tr></tbody></table>

creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Modelli di tumore ortotopico sono attualmente il modo migliore per studiare le caratteristiche di un tipo di tumore, con e senza l&#39;intervento, nel contesto di un animale vivo - in particolare in siti con caratteristiche uniche fisiologici e architettonici come il cervello in vitro e modelli ectopiche non possono. tenere conto di caratteristiche quali vasi, il sangue barriera del cervello, il metabolismo, somministrazione di farmaci e la tossicità, e una miriade di altri fattori rilevanti. Modelli ortotopico hanno i loro limiti troppo, ma con adeguate cellule tumorali tecnica di interesse possono essere innestate con esattezza in tessuto che più strettamente imita le condizioni nel cervello umano. Utilizzando metodi che forniscono i volumi misurati con precisione a definire con precisione posizioni ad una velocità costante e pressione, modelli murini di tumori cerebrali umani con tassi di crescita prevedibili possono essere riproducibile creati e sono adatti per un&#39;analisi attendibile dei vari interventi. Il protocollo qui descritto si concentra sul tedettagli chnical di progettazione e preparazione per l&#39;iniezione intracranica, eseguire l&#39;intervento chirurgico, e garantire la crescita del tumore e di successo riproducibile e fornisce i punti di partenza per una serie di condizioni che possono essere personalizzati per una vasta gamma di diversi modelli di tumore al cervello.

Xenotrapianti intracranica affidabili possono essere creati con questa tecnica descritta. Identificare le strutture critiche del cranio del mouse (Figura 1), consentirà il riconoscimento del bregma e guidare il ricercatore in una posizione di iniezione precisa e riproducibile. In questi studi la linea parentale U251, U251 cellule trasfettate con luciferasi (U251-Luc), o U87 immortalato cellule di coltura di tessuti GBM umani sono stati sospesi a 4-6 ml di SF-DMEM e iniettato 2,5 millimetri laterale (a d...

Il cervello è un sito unico con qualità che non sono ben rappresentati da in vitro o analisi ectopiche. Modelli di mouse ortotopico con caratteristiche di localizzazione e di crescita riproducibili possono essere attendibilmente creati con iniezioni intracraniche utilizzando uno strumento di fissazione stereotassico e una pompa a siringa a bassa pressione.

Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un modello di tumore cerebrale umano coerente e riproducibile che possa essere utilizzato per la verifica e il confronto accurati di nuove strategie terapeutiche. Ciò si ottiene preparando l'animale per l'intervento chirurgico e individuando il sito corretto per l'iniezione. Una volta individuato, viene praticato un foro nel cranio e una siringa viene abbassata alla profondità corretta.Per ottenere la crescita tumorale, le cellule vengono quindi iniettate in modo lento e controllato, seguito da un ritiro ritardato e graduale dell'ago. In definitiva, è possibile sviluppare un modello murino coerente con una crescita tumorale istopatologicamente simile alla condizione umana e i tassi di crescita possono essere misurati mediante imaging in vivo basato su Lucci. La precisione di questa tecnica è fondamentale per comprendere nuove strategie terapeutiche per i tumori cerebrali umani.La localizzazione variabile dell'iniezione tumorale può portare a cambiamenti nella crescita del tumore dovuti al microambiente, alla somministrazione di farmaci o ad altre cose che variano notevolmente tra le diverse aree del cervello. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché le fasi che coinvolgono il posizionamento del mouse e la localizzazione del sito di iniezione richiedono manipolazioni tridimensionali, che non sono facilmente descrivibili in formato scritto o grafico. Per iniziare, pulire e decontaminare un telaio stereotassico di topo e tutte le altre attrezzature necessarie per l'intervento chirurgico.Utilizzando le impostazioni ottimizzate per il modello scelto programma, i parametri di iniezione e altre variabili per il funzionamento della pompa a siringa. Successivamente, disporre gli strumenti chirurgici in autoclave nell'area di lavoro includono almeno due punte da trapano dentali da 1,0 millimetri per le procedure seriali. Disinfettare gli strumenti chirurgici con etanolo al 70%, seguito da 30 secondi in uno sterilizzatore a microsfere tra ogni animale o come consigliato dai protocolli IACUC.Infine, raccogli tutte le forniture mediche e i materiali monouso necessari Una punta fine, un pennarello indelebile per marcare il cranio dovrebbe essere decontaminato e dedicato all'uso chirurgico. Dopo la tripsina resus, sospendere le cellule in PBS e pellet mediante centrifugazione Resus. Sospendi le cellule in circa cinque millilitri di dmem libero dal siero per piastra da 100 millimetri.Successivamente, conta le cellule vitali utilizzando un emometro, un citometro o un contatore di cellule automatizzato. Dopo il conteggio, regolare la densità delle cellule vive pellettando le cellule e sospendendo un dmm SF. Conservare le celle refrigerate su ghiaccio o impacco freddo, ma non lasciare che le celle si congelino.Mescolare delicatamente con un dito, indurre l'anestesia dell'animale e confermare che l'animale sia adeguatamente sedato controllando la presenza di riflessi di scrittura o mancanza di attività. Una volta anestetizzato, coprire il mouse con garze per riscaldarlo e monitorare regolarmente l'animale durante la procedura. Quindi, posiziona il mouse in un fotogramma stereotassico.Utilizzando la barra del pallet e le barre auricolari, cerca di mantenere la superficie dell'orecchio verso gli occhi il più orizzontale possibile. Infine, lubrificare gli occhi con un unguento oftalmico e pulire due volte la pelle tra le orecchie e gli occhi con applicazioni alternate di un antisettico allo iodio povidone ed etanolo al 70%. Dopo aver iniettato un analgesico per via sottocutanea, confermare che l'animale sia completamente anestetizzato controllando il riflesso di pizzicamento delle dita.Immediatamente prima dell'incisione cutanea, praticare una piccola incisione per esporre il BMA e il sito di un'iniezione. Un taglio diagonale da un punto tra l'asse della linea mediana e l'occhio destro verso l'orecchio destro consente l'asse sia al bgma che al sito di iniezione. Ritrarre la pelle e utilizzare un batuffolo di cotone sterile per asciugare la superficie del cranio.Tamponare l'osso con un altro tampone, inumidito con acqua ossigenata. Per visualizzare la bgma, bloccare una siringa vuota con l'ago nella micropompa e manovrare la punta direttamente sopra la bgma. Azzerare le coordinate sulla console di allineamento.Spostare l'ago a 2,5 millimetri lateralmente e 1,5 millimetri anteriormente con rispetto. Torema. Utilizzando le manopole di controllo sull'unità stereotassica, sollevare leggermente la siringa e segnare la posizione esatta sul cranio con una punta di feltro dedicata. Penna. Se la superficie esterna del cranio non è più a livello del bgma sul piano dorsale, reimpostare la lettura ventrale dorsale a zero per assicurarsi che la profondità dell'iniezione sia corretta.Praticare un piccolo foro nel cranio con un trapano rotante portatile dotato di una punta dentale sterile. Tenere il trapano ad angolo rispetto al cranio e toccare molto delicatamente la punta dell'osso. Fermarsi prima di perforare completamente l'osso.Si ottiene l'iniezione più pulita con il minor trauma. Quando il cranio viene perforato con l'ago della siringa durante l'iniezione cellulare, rimuovere la polvere ossea con un batuffolo di cotone inumidito in PBS o soluzione fisiologica. Rimettere la siringa nella pompa e abbassare l'ago fino al foro della fresa.Per confermare la posizione, mescolare delicatamente la sospensione cellulare e aspirare le cellule nella siringa. Utilizzando il controller della pompa, evitare bolle e grumi e pulire l'ago con un tampone imbevuto di alcol. Per rimuovere le cellule contaminanti sulla superficie esterna, abbassare l'ago al livello della superficie del cranio.Quindi abbassare lentamente l'ago. Forare l'intero spessore del cranio e penetrare nel cervello a una profondità di quattro millimetri ventrali nel corso di un minuto, prima di ritirare lentamente l'ago a 3,5 millimetri ventrali, confermare che i parametri corretti siano stati inseriti nel controller della pompa e premere il pulsante di esecuzione. Fermarsi. Per iniettare automaticamente le cellule, osservare la siringa e assicurarsi che lo stantuffo si muova nel cilindro.Lasciare l'ago in posizione per uno o due minuti prima di estrarre molto lentamente l'ago dal tessuto. L'ago deve essere rimosso nel corso di cinque minuti. Usa un batuffolo di cotone per tamponare l'area intorno al foro della fresa e lascia i bordi della pelle aperti per consentire all'osso di asciugarsi.Estrarre la siringa dalla pompa e riempirla rapidamente con acqua sterile ed etanolo. Quindi, applica la cera d'osso sterile sul foro della fresa e usa l'estremità di legno di un batuffolo di cotone sterile per tamponare la cera sopra e dentro l'osso. Se la superficie è asciugata adeguatamente, dovrebbe aderire Dopo aver suturato la ferita, ridurre l'isof fluoro allo 0% e rimuovere il topo dall'unità stereotassica.Posizionare l'animale su una superficie riscaldata e osservare fino a quando non si riprende completamente. È importante pulire tutti gli strumenti e le attrezzature utilizzando etanolo al 70% e uno sterilizzatore a perline o disinfettare tra ogni animale. I topi iniettati devono essere monitorati per due giorni dopo la procedura per segni di dolore, infezione o altre complicazioni.Valutare i topi per segni clinici di paralisi della malattia, diminuzione dell'attività, perdita di peso, convulsioni o malattia generale al momento desiderato. Dopo l'iniezione, monitorare lo sviluppo del tumore mediante risonanza magnetica o sistemi di imaging in vivo. Queste due immagini pesate MRIT confrontano un tumore derivato da cellule U 87 con il tumore derivato da cellule U2 51.I volumi tumorali tracciati nel tempo mostrano una finestra riproducibile di sviluppo e crescita del tumore che è coerente in tutti gli esperimenti. Un'immagine IVIS di cellule GBM trasdotte U2 51 iniettate per via intracranica in topi nudi, rivela che il topo a sinistra è stato iniettato con successo e mostra un segnale vocalizzato molto forte nella posizione desiderata. Mentre il mouse a destra dimostra un risultato non riuscito da una posizione o una tecnica di iniezione impropria.La dimensione del tumore è stimata dall'attività dei luciferi nella regione cerebrale di interesse e tracciata nel tempo. La linea blu corrisponde al topo con un'iniezione intracranica riuscita, mentre la linea rossa corrisponde al topo con spostamento delle cellule tumorali verso la colonna vertebrale dopo h ed e, colorando il tumore dalle cellule U 87 GBM, mostra un'area di crescita tumorale densa e tessuto cerebrale normale adiacente con invasione microscopica di cellule maligne. Questa sezione del centro di un tumore derivato da cellule U2 51 GBM replica molto da vicino la bizzarra istopatologia con cellule maligne multinucleate osservate nel tipico GBM umano.Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la riproducibilità del modello tumorale dipende dal posizionamento preciso e sicuro della testa del topo e dalla localizzazione coerente del sito di iniezione. Inoltre, è essenziale una velocità graduale e una pressione di iniezione costante. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della neuro-oncologia di esplorare nuove strategie terapeutiche per i tumori cerebrali umani, rimuovendo parte della variabilità aggravata dalla localizzazione imprecisa dell'iniezione di cellule tumorali cerebrali.

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Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

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