Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un modello di tumore cerebrale umano coerente e riproducibile che possa essere utilizzato per la verifica e il confronto accurati di nuove strategie terapeutiche. Ciò si ottiene preparando l'animale per l'intervento chirurgico e individuando il sito corretto per l'iniezione. Una volta individuato, viene praticato un foro nel cranio e una siringa viene abbassata alla profondità corretta.

Per ottenere la crescita tumorale, le cellule vengono quindi iniettate in modo lento e controllato, seguito da un ritiro ritardato e graduale dell'ago. In definitiva, è possibile sviluppare un modello murino coerente con una crescita tumorale istopatologicamente simile alla condizione umana e i tassi di crescita possono essere misurati mediante imaging in vivo basato su Lucci. La precisione di questa tecnica è fondamentale per comprendere nuove strategie terapeutiche per i tumori cerebrali umani.

La localizzazione variabile dell'iniezione tumorale può portare a cambiamenti nella crescita del tumore dovuti al microambiente, alla somministrazione di farmaci o ad altre cose che variano notevolmente tra le diverse aree del cervello. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché le fasi che coinvolgono il posizionamento del mouse e la localizzazione del sito di iniezione richiedono manipolazioni tridimensionali, che non sono facilmente descrivibili in formato scritto o grafico. Per iniziare, pulire e decontaminare un telaio stereotassico di topo e tutte le altre attrezzature necessarie per l'intervento chirurgico.

Utilizzando le impostazioni ottimizzate per il modello scelto programma, i parametri di iniezione e altre variabili per il funzionamento della pompa a siringa. Successivamente, disporre gli strumenti chirurgici in autoclave nell'area di lavoro includono almeno due punte da trapano dentali da 1,0 millimetri per le procedure seriali. Disinfettare gli strumenti chirurgici con etanolo al 70%, seguito da 30 secondi in uno sterilizzatore a microsfere tra ogni animale o come consigliato dai protocolli IACUC.

Infine, raccogli tutte le forniture mediche e i materiali monouso necessari Una punta fine, un pennarello indelebile per marcare il cranio dovrebbe essere decontaminato e dedicato all'uso chirurgico. Dopo la tripsina resus, sospendere le cellule in PBS e pellet mediante centrifugazione Resus. Sospendi le cellule in circa cinque millilitri di dmem libero dal siero per piastra da 100 millimetri.

Successivamente, conta le cellule vitali utilizzando un emometro, un citometro o un contatore di cellule automatizzato. Dopo il conteggio, regolare la densità delle cellule vive pellettando le cellule e sospendendo un dmm SF. Conservare le celle refrigerate su ghiaccio o impacco freddo, ma non lasciare che le celle si congelino.

Mescolare delicatamente con un dito, indurre l'anestesia dell'animale e confermare che l'animale sia adeguatamente sedato controllando la presenza di riflessi di scrittura o mancanza di attività. Una volta anestetizzato, coprire il mouse con garze per riscaldarlo e monitorare regolarmente l'animale durante la procedura. Quindi, posiziona il mouse in un fotogramma stereotassico.

Utilizzando la barra del pallet e le barre auricolari, cerca di mantenere la superficie dell'orecchio verso gli occhi il più orizzontale possibile. Infine, lubrificare gli occhi con un unguento oftalmico e pulire due volte la pelle tra le orecchie e gli occhi con applicazioni alternate di un antisettico allo iodio povidone ed etanolo al 70%. Dopo aver iniettato un analgesico per via sottocutanea, confermare che l'animale sia completamente anestetizzato controllando il riflesso di pizzicamento delle dita.

Immediatamente prima dell'incisione cutanea, praticare una piccola incisione per esporre il BMA e il sito di un'iniezione. Un taglio diagonale da un punto tra l'asse della linea mediana e l'occhio destro verso l'orecchio destro consente l'asse sia al bgma che al sito di iniezione. Ritrarre la pelle e utilizzare un batuffolo di cotone sterile per asciugare la superficie del cranio.

Tamponare l'osso con un altro tampone, inumidito con acqua ossigenata. Per visualizzare la bgma, bloccare una siringa vuota con l'ago nella micropompa e manovrare la punta direttamente sopra la bgma. Azzerare le coordinate sulla console di allineamento.

Spostare l'ago a 2,5 millimetri lateralmente e 1,5 millimetri anteriormente con rispetto. Torema. Utilizzando le manopole di controllo sull'unità stereotassica, sollevare leggermente la siringa e segnare la posizione esatta sul cranio con una punta di feltro dedicata. Penna. Se la superficie esterna del cranio non è più a livello del bgma sul piano dorsale, reimpostare la lettura ventrale dorsale a zero per assicurarsi che la profondità dell'iniezione sia corretta.

Praticare un piccolo foro nel cranio con un trapano rotante portatile dotato di una punta dentale sterile. Tenere il trapano ad angolo rispetto al cranio e toccare molto delicatamente la punta dell'osso. Fermarsi prima di perforare completamente l'osso.

Si ottiene l'iniezione più pulita con il minor trauma. Quando il cranio viene perforato con l'ago della siringa durante l'iniezione cellulare, rimuovere la polvere ossea con un batuffolo di cotone inumidito in PBS o soluzione fisiologica. Rimettere la siringa nella pompa e abbassare l'ago fino al foro della fresa.

Per confermare la posizione, mescolare delicatamente la sospensione cellulare e aspirare le cellule nella siringa. Utilizzando il controller della pompa, evitare bolle e grumi e pulire l'ago con un tampone imbevuto di alcol. Per rimuovere le cellule contaminanti sulla superficie esterna, abbassare l'ago al livello della superficie del cranio.

Quindi abbassare lentamente l'ago. Forare l'intero spessore del cranio e penetrare nel cervello a una profondità di quattro millimetri ventrali nel corso di un minuto, prima di ritirare lentamente l'ago a 3,5 millimetri ventrali, confermare che i parametri corretti siano stati inseriti nel controller della pompa e premere il pulsante di esecuzione. Fermarsi. Per iniettare automaticamente le cellule, osservare la siringa e assicurarsi che lo stantuffo si muova nel cilindro.

Lasciare l'ago in posizione per uno o due minuti prima di estrarre molto lentamente l'ago dal tessuto. L'ago deve essere rimosso nel corso di cinque minuti. Usa un batuffolo di cotone per tamponare l'area intorno al foro della fresa e lascia i bordi della pelle aperti per consentire all'osso di asciugarsi.

Estrarre la siringa dalla pompa e riempirla rapidamente con acqua sterile ed etanolo. Quindi, applica la cera d'osso sterile sul foro della fresa e usa l'estremità di legno di un batuffolo di cotone sterile per tamponare la cera sopra e dentro l'osso. Se la superficie è asciugata adeguatamente, dovrebbe aderire Dopo aver suturato la ferita, ridurre l'isof fluoro allo 0% e rimuovere il topo dall'unità stereotassica.

Posizionare l'animale su una superficie riscaldata e osservare fino a quando non si riprende completamente. È importante pulire tutti gli strumenti e le attrezzature utilizzando etanolo al 70% e uno sterilizzatore a perline o disinfettare tra ogni animale. I topi iniettati devono essere monitorati per due giorni dopo la procedura per segni di dolore, infezione o altre complicazioni.

Valutare i topi per segni clinici di paralisi della malattia, diminuzione dell'attività, perdita di peso, convulsioni o malattia generale al momento desiderato. Dopo l'iniezione, monitorare lo sviluppo del tumore mediante risonanza magnetica o sistemi di imaging in vivo. Queste due immagini pesate MRIT confrontano un tumore derivato da cellule U 87 con il tumore derivato da cellule U2 51.

I volumi tumorali tracciati nel tempo mostrano una finestra riproducibile di sviluppo e crescita del tumore che è coerente in tutti gli esperimenti. Un'immagine IVIS di cellule GBM trasdotte U2 51 iniettate per via intracranica in topi nudi, rivela che il topo a sinistra è stato iniettato con successo e mostra un segnale vocalizzato molto forte nella posizione desiderata. Mentre il mouse a destra dimostra un risultato non riuscito da una posizione o una tecnica di iniezione impropria.

La dimensione del tumore è stimata dall'attività dei luciferi nella regione cerebrale di interesse e tracciata nel tempo. La linea blu corrisponde al topo con un'iniezione intracranica riuscita, mentre la linea rossa corrisponde al topo con spostamento delle cellule tumorali verso la colonna vertebrale dopo h ed e, colorando il tumore dalle cellule U 87 GBM, mostra un'area di crescita tumorale densa e tessuto cerebrale normale adiacente con invasione microscopica di cellule maligne. Questa sezione del centro di un tumore derivato da cellule U2 51 GBM replica molto da vicino la bizzarra istopatologia con cellule maligne multinucleate osservate nel tipico GBM umano.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la riproducibilità del modello tumorale dipende dal posizionamento preciso e sicuro della testa del topo e dalla localizzazione coerente del sito di iniezione. Inoltre, è essenziale una velocità graduale e una pressione di iniezione costante. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della neuro-oncologia di esplorare nuove strategie terapeutiche per i tumori cerebrali umani, rimuovendo parte della variabilità aggravata dalla localizzazione imprecisa dell'iniezione di cellule tumorali cerebrali.