Sintesi di Immunotargeted magneto-plasmonica nanocluster

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica con un forte momento magnetico e un forte vicino infrarosso (NIR) assorbanza. Il protocollo include anche anticorpi coniugazione alle nanoparticelle attraverso la porzione Fc per varie applicazioni biomediche che richiedono il targeting molecolare specifico.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sintetizzare nano cluster magnetoplasmonici immuno-mirati con un forte momento magnetico e una forte assorbanza nel vicino infrarosso. Ciò si ottiene sintetizzando prima le nanoparticelle del nucleo di ossido di ferro. Il secondo passo consiste nel depositare un guscio d'oro su nanoparticelle di nucleo di ossido di ferro.

Successivamente, i nano cluster sono formati da un approccio di microemulsione di olio e acqua. Il passaggio finale consiste nel coniugare gli anticorpi monoclonali ai nano cluster. In definitiva, l'imaging in campo oscuro viene utilizzato per mostrare la specificità molecolare dell'approccio immuno mirato ai nano cluster magnetoplasmonici che fornisce la combinazione di una semplice nanoparticelle di sintesi con un forte momento magnetico senza sacrificare le proprietà super paramagnetiche e forti assorbenti infrarossi visibili del ginocchio che affrontano tutte le principali limitazioni dei metodi precedenti, e la procedura sarà dimostrata dallo studente Grady, Frank W, che ha sviluppato la procedura nel mio laboratorio: per fare le nanoparticelle, per prima cosa impostare il LabWare in una cappa aspirante, collegare un pallone a fondo rotondo a un condensatore e immergerlo in un bagno d'olio di silicone su una piastra calda.

Monitora il bagno con un termometro in grado di leggere fino a 160 gradi Celsius indossando indumenti protettivi. Iniziare a combinare i reagenti in un pallone di metallo poiché le temperature di reazione sono molto elevate per il Pyrex. Per fare la sospensione magnetica di nanoparticelle, combinare ferro acetilato acido oleico ole lamine uno due H, aec, diolo e fenil etere.

Mescola energicamente il composto e scaldalo a 250-260 gradi Celsius. Non riscaldarlo più in alto, altrimenti l'etere fenilico bollirà e il recipiente scoppierà. Mantenere l'alta temperatura per un'ora a riflusso e poi lasciare raffreddare la reazione.

Torna a temperatura ambiente per depositare un guscio d'oro su nanoparticelle del nucleo magnetico. Aggiungere i seguenti materiali a un nuovo pallone a fondo tondo, acetato d'oro, acido oleico, ole lamine uno, due. Lui aec dial e fenil etere.

Quindi aggiungere cinque millilitri di sospensione di nanoparticelle magnetiche. Riscalda questa reazione a 180 gradi Celsius e tienila lì a riflusso per un'ora. Quindi attendere che la soluzione si raffreddi a temperatura ambiente.

Per precipitare le nanoparticelle primarie ibride, aggiungere 50 millilitri di etanolo alla sospensione. Quindi caricare la sospensione in una provetta da centrifugazione e farla girare verso il basso. Ora risospendere il pellet in 25 millilitri di esano usando un sonicato e aggiungere nuovamente 25 millilitri di etanolo e ripetere la centrifugazione.

Ripetere il processo di lavaggio altre tre volte. Infine, essiccare il pellet di nanoparticelle ibride primarie in un essiccato sottovuoto per una notte. Non procedere fino a quando le particelle non sono completamente asciutte.

Per realizzare i nano cluster ibridi magnetoplasmonici, si inizia sospendendo le nanoparticelle primarie secche in un millilitro di esano. Utilizzando un sonicato, procedere quando non è presente alcun precipitato visibile. Successivamente, aggiungere la sospensione di nanoparticelle a 10 millilitri di solfato di sodio esal in una fiala di vetro da 20 millilitri, cercare di mantenere la soluzione in due fasi, tappare e agitare la fiala a mano.

Quindi sonicare la soluzione bifase per due ore. Posizionare la fiala vicino al centro della vasca. Il bagno si riscalderà gradualmente dopo due ore.

Scaldare la miscela a bagnomaria a 80 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi lasciarlo raffreddare di nuovo a temperatura ambiente. Centrifugare ora la sospensione a 100 G per 30 minuti.

Conservare il surnatante e risospendere il pellet in citrato di sodio 0,1 millimolare utilizzando 10 minuti di sonicazione. Questi nano cluster dovrebbero avere un diametro di circa 180 nanometri. Centrifugare successivamente, il surnatante risparmiato a 400 g per 30 minuti.

Anche in questo caso, conservare il surnatante e risospendere il pellet in citrato di sodio 0,1 millimolare utilizzando 10 minuti di sonicazione. I nano cluster in questa sospensione Resus hanno un diametro di circa 130 nanometri. Centrifugare ora il surnatante risparmiato a 1500 G per 30 minuti e risospendere il pellet come prima per nano cluster con un diametro di circa 90 nanometri.

Per l'analisi, trasferire 300 microlitri di ciascuna sospensione in pozzetti individuali e in una piastra da 96 pozzetti e leggere i loro spettri di assorbimento UV vis NIR. Trasferisci anche 10 microlitri su griglie di rame rivestite di carbonio per l'imaging TEM per coniugare gli anticorpi ai nano cluster. Innanzitutto, sostituire il terreno della soluzione anticorpale con cumuli in modo che possano essere ossidati.

Trasferire 100 microlitri di anticorpi in un filtro da centrifuga con cutoff molecolare da 10 K e aggiungere 3,9 millilitri di cumuli millimolari, pH 7,2. Quindi centrifugare a 3, 250 g a otto gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di sodio 100 millimolare par I date per ossidare gli anticorpi e coprire la fiala con un foglio.

Lasciare che la reazione si incubi in una stanza. Agitatore orbitale di temperatura per 30 minuti dopo. Estinguere la reazione di ossidazione aggiungendo mezzo millilitro di un XPBS.

Ora agli anticorpi ossidati, aggiungere due microlitri della soluzione linker e impostare la reazione in modo che agiti per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, filtrare la reazione attraverso un altro filtro di cutoff del peso molecolare da 10 K a 3, 250 G per 20 minuti e a otto gradi Celsius. Quindi trasferire l'anticorpo in una nuova fiala e portare il volume fino a 100 microlitri in un XPBS, riportandoli alla loro concentrazione di lavoro originale, pronti per essere coniugati ai nano cluster.

Ora raccogli 100 microlitri di sospensione nano cluster con un OD di circa 1,0. Aggiungere un microlitro di anticorpi modificati e incubarli a temperatura ambiente per due ore agitando leggermente. Dopo due ore, aggiungere 10 microlitri di un millimolare di tiolo da cinque kilodalton.

Peg quindi incubare la reazione per 15 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Ora pellettare i nano cluster coniugati con anticorpo a 830 G per tre minuti e risospendere il pellet in 100 microlitri di peso al 2% per volume cinque. Il PEG di Kilodalton in PBS a pH 7,2 misura l'assorbanza della sospensione rispetto a quella dei nano cluster nudi, dovrebbe esserci uno spostamento verso il rosso dopo la coniugazione.

Le nanoparticelle possono aggregarsi, come notato da uno spostamento significativo nello spettro NIR rosso. Se ciò accade, aumentare la concentrazione di peg tiolico a cinque millimolari, aumentare il tempo di incubazione a 30 minuti e diminuire gradualmente la velocità centrifuga di 200 G fino a quando le nanoparticelle non si aggregano più. Le particelle di ossido di ferro sintetizzate avevano un diametro di circa cinque nanometri.

A seguito di deposizione di conchiglie d'oro. Le loro dimensioni sono aumentate a circa sei nanometri. Il colore colloidale cambia dal marrone per le nanoparticelle di ossido di ferro al rosso viola dopo la deposizione del guscio d'oro, e infine a un colore grigio porpora dopo l'assemblaggio delle particelle primarie.

Questi nano cluster hanno un diametro di circa 180 nanometri. Gli spettri assorbenti di varie dimensioni delle particelle mostrano che le nanoparticelle primarie del guscio d'oro del nucleo di ossido di ferro hanno un picco di risonanza distintivo a 530 nanometri. Questo non è presente nelle particelle di ossido di ferro nudo.

Inoltre, i cluster hanno un assorbente NIR molto più forte dopo aver coniugato i due anticorpi anti EGFR e anti HER ai nano cluster. La loro specificità è stata verificata rispetto a una linea cellulare di cancro della pelle EGFR positiva e a una linea cellulare di cancro al seno HER due positivi, entrambi i tipi etichettati come cellule appropriate. Al contrario, i nano cluster pegilati non bersaglio non marcano nessuna delle due linee cellulari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare il magneto immunomirato più i cluster mononatali in un semestre. Questa tecnica può essere eseguita in poche ore se eseguita correttamente. Questo nuovo non materiale può essere utilizzato in una varietà di interessanti applicazioni biomediche, tra cui il miglioramento del contrasto nelle modalità di imaging magnetico, la cattura e il rilevamento simultanei di cellule tumorali circolanti e l'imaging molecolare multimodale combinato con la terapia fototermica del cancro.