Generazione di Genomic eliminazioni in linee cellulari di mammiferi via CRISPR / Cas9

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare il sistema CRISPR Cas nine nucleasi per creare delezioni genomiche. Prima elettropurato, i due plasmidi CRISPR e un plasmide reporter GFP contemporaneamente nelle cellule. Quindi, utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, isolare il 3% superiore delle cellule che esprimono GFP.

Successivamente, piastra le cellule selezionate alla diluizione limitante e screening per cloni di delezione bioallelica utilizzando la PCR convenzionale. In definitiva, CRISPR Cas nine può essere utilizzato per studiare geni ed elementi genetici producendo alleli di delezione con perdita di funzione Rispetto alle mutazioni frameshift prodotte da un singolo RNA guida, grandi delezioni generate dal sistema CRISPR Cas nine nucleasi possono aiutare a garantire mutazioni con perdita di funzione. Questo approccio consente anche uno screening facile ed economico tramite una PCR convenzionale.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che lo screening di piccoli indel creati da un singolo RNA guida è tecnicamente impegnativo, laborioso e costoso Gli alleli di delezione sono anche particolarmente informativi per lo studio di elementi genetici non di rivestimento. Per ogni coppia di pellet CRISPR, due volte 10 alle sei celle cresciute in sospensione. Risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione di elettroporazione e quindi trasferirle in un QAT di elettroporazione.

Aggiungi cinque microgrammi di CRISPR Cas nine construct SG RNAA cinque microgrammi di CRISPR Cas nine. Costruire SG a B e 0,5 microgrammi dell'espressione GFP costruire la pipetta su e giù più volte delicatamente per mescolare. Cerca di evitare di produrre bolle utilizzando un sistema di elettroporazione.

Elettropurificare le cellule a 250 volt per cinque millisecondi in una vete di due millimetri con una pipetta di trasferimento sterile, trasferire immediatamente la soluzione in un millilitro di terreno di coltura preriscaldato. Incubare le cellule a 30 gradi Celsius per 24-72 ore. Passare le cellule attraverso un filtro sterile da 50 micron in un tubo fax.

Quindi smistamento via fax del 3% superiore delle cellule positive alla GFP per arricchirle per le cellule che hanno ricevuto alti livelli di plasmidi. Dopo aver ottimizzato le condizioni di diluizione limite per le cellule di interesse, le cellule sono state suddivise in una piastra da 96 pozzetti e una diluizione di 30 cellule per piastra con 100 microlitri di terreno di coltura cellulare per pozzetto. Per le restanti celle sfuse selezionate, congelare metà delle celle per la futura placcatura.

Piastra l'altra metà per la vagliatura e la convalida del primer. Incubare queste celle di massa a 37 gradi Celsius per tre-sette giorni. Lasciare incubare i cloni a 37 gradi Celsius per sette-14 giorni a seconda del tempo di raddoppio della linea cellulare.

Utilizzato per isolare i resuri di DNA genomico, sospendere i pellet di cellule parentali e bulk in 50 microlitri di soluzione di estrazione del DNA. Eseguire il campione in un termociclatore per estrarre il DNA genomico. Quindi misurare la concentrazione di DNA.

Ora assembla una reazione PCR da 20 microlitri combinando 10 microlitri di due miscele XPCR. 0,5 microlitri di primer diretto da 10 micromolari, 0,5 microlitri di primer inverso da 10 micromolari, da 50 a 100 nanogrammi di DNA genomico e acqua fino a 20 microlitri. Condurre la PCR per la banda di non delezione e la banda di delezione in reazioni separate.

Successivamente, posizionare i campioni in un termociclatore ed eseguire utilizzando 35 cicli con una temperatura in ginocchio A di 60 gradi Celsius, come descritto nel protocollo scritto allegato. Risolvere i campioni su un gel al 2% di aros a 10 volt per centimetro utilizzando un tampone XTAE. Quindi esaminare i campioni per la presenza o l'assenza di bande di non delezione e delezione.

Considerare una strategia per multiplexare le coppie di primer PCR con delezione e non con delezione in un'unica reazione. In alternativa, è possibile eseguire separatamente le reazioni PCR con e senza delezione. Per le cellule in sospensione, trasferire tutti i cloni in un'unica piastra da 96 pozzetti che contiene già 50 microlitri di terreno di coltura cellulare per pozzetto.

Quindi trasferire 50 microlitri da ciascun pozzetto a una piastra PCR da 96 pozzetti. In alternativa, per le cellule di aderenza, la tripsina, gli occhi, i cloni prima del trasferimento in una singola piastra a 96 pozzetti. Quindi, trasferire 50 microlitri da ciascun pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti, centrifugare la piastra PCR a 400 volte G per cinque minuti e rimuovere il surnatante facendo scorrere la piastra PCR su un lavandino.

Ora aggiungere 50 microlitri di soluzione di estrazione del DNA per pozzetto e risospendere i pellet cellulari dopo l'estrazione del DNA genomico, eseguire reazioni di PCR per rilevare le bande di non delezione e delezione dai cloni. Risolvi i prodotti PCR su un gel al 2% di aros a 10 volt per centimetro. Utilizzo di un buffer XTAE.

Identificare i cloni con la delezione desiderata e amplificare le colture in una piastra o in un pallone più grande. Nell'esempio, si osservano da sinistra a destra le cellule parentali, tre cloni non con delezione, tre cloni con delezione mono allelica e tre cloni con delezione biallelica. L'uso di più coppie SG r NNA non sovrapposte può aiutare a controllare gli effetti fuori bersaglio.

Ogni coppia porterebbe alla produzione di una cancellazione unica. Il breakpoint che mira a coppie SG in varie posizioni rispetto al gene può essere utilizzato per eliminare l'intero corpo genico per creare indel frameshift, anche se uno o entrambi gli alleli non sono stati eliminati o per consentire la rottura di una particolare isoforma. In questo esperimento.

Per quanto riguarda la delezione dell'intero gene, PIM one two SG RNA pairs sono state progettate clonate nel vettore di espressione PX 3 3 0 e consegnate alle cellule MEL mediante elettroporazione. Insieme al reporter GFP, il 3% delle cellule GFP positive è stato placcato clonalmente alla delezione limitante e sottoposto a screening mediante PCR per cloni di delezione monoallelica e bioallelica non delezione per questa delezione PIM uno. I cloni con delezione bioallelica sono stati selezionati per un'ulteriore proliferazione dopo aver concesso cinque giorni per l'espansione.

Ogni clone è stato ritestato mediante PCR del DNA genomico per confermare la delezione e la delezione del BIC. Gli ampliconi sono stati sottoposti a sequenziamento Sanger per identificare la delezione precisa. L'RNA è stato isolato da cloni di delezione BIC e analizzato mediante R-T-Q-P-C-R per confermare la perdita dell'espressione di PIM uno.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata nel giro di poche settimane per identificare i cloni di delezione vitalica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il sistema CRISPR CAS a nove nucleasi per creare delezioni genomiche mediante l'analisi dei plasmidi CRISPR, la selezione delle cellule luminose GFP e lo screening di singoli cloni mediante PCR convenzionale per i cloni con delezione BioE.