Name: Rilevamento dei leucociti umani Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizzando libero-Label Biosensor Tecnologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Scopri il rilevamento di antigeni tumorali HLA nei campioni di pazienti con tecnologia biosensor senza marcatori. Questo metodo consente la stratificazione rapida per immunoterapia mirata nel cancro al seno.

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Questi studi sono stati supportati in parte dalla Development Corporation di Abilene, che fornisce spazio di laboratorio e supporto salariale per Experimmune, un Centro per lo Sviluppo Immunoterapico presso il Texas Tech University, Health Sciences Center e Resonant Sensors Incorporated.

Etica dichiarazione: campioni De-identificati tessuti e plasma umano sono stati ottenuti da Hendrick Medical Center in un Institutional Review Board ha approvato il protocollo. 1. Aggiunta di anticorpo biotilinato NOTA: Il monitoraggio di questo passaggio è facoltativo. Vedere protocollo alternativo, se non di monitoraggio. <ol><li> Ottenere piastre in commercio derivati ​​rivestito avidina (vedi Materiali e attrezzature Table). </li><li> Aggiungere 50 ml di fosfato salina tamponata (PBS) pH 7,2 per pozzi. NOTA: Preincubare PBS a 28 ° C per minimizzare relativi alla temperatura risonanza turni. </li><li> Aprire software dello scanner bioassay e seguire l&#39;installazione guidata per definire la procedura sperimentale che prevede la selezione di bianchi, standardi e campioni nel layout di piastra, regolazione della temperatura (28 ° C), il numero di scansioni al minuto (1), e la durata della sperimentazione ( 150 min per ospitare per fasi preparative). </li&gt; <li> Inserire la piastra di test predisposto nello scanner bioassay libera etichetta e avviare la prima scansione. Quando la prima scansione, selezionare &quot;auto di riferimento per iniziare&quot;. La linea di base è l&#39;insieme iniziale di scansioni raccolti all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Se questa è la prima lettura effettuata su questa piastra specifica, consentire allo scanner di funzionare per equilibrare la temperatura ed eliminare la deriva della linea di base. Vedere la Figura 2 per uno screenshot di una linea di base seguito da aggiunta del campione. </li><li> Dopo la linea di base è stabilizzato, o almeno 5 scansioni, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra. </li><li> Rimuovere PBS dal dumping nel lavandino e aggiungere 50 microlitri RL21A anticorpo biotinilato a [10 mg / ml in PBS pH 7,2] a tutti, ma pozzetti di controllo sulla piastra. Aggiungere 50 microlitri PBS ai pozzetti di controllo. </li><li> Inserire la piastra posteriore nello scanner bioassay e riprendere la lettura fino a saturazione, di circa 1,5 ore. </li><li> Pausa di lettura ed espellere la piastra. </li><li> Lavare il<html> piastra 3 volte con 200 microlitri / pozzetto tampone fosfato + 0,05% Tween 20 (PBST) seguito da 3 lavaggi con 200 microlitri / pozzetto di PBS pH 7,2. Ripetere con PBS. Toccare eccesso PBS dalla piastra su carta assorbente prima di passare alla fase successiva. NOTA: Questa fase può essere eseguita su un lavatore automatico delle lastre o lavare la piastra 3 volte con 200 microlitri PBST scaricando liquido in un lavandino e sostituendo PBST con una pipetta. </li><li> Aggiungere 50 ml di PBS pH 7,2 per tutti i pozzi attivi. </li><li> Inserire la piastra posteriore nello scanner bioassay e riprendere la lettura per il monitoraggio post-wash risonanza. </li><li> Fermare la lettura ed espellere la piastra. </li></ol> Protocollo alternativo per Step 1: <ol start="13"><li> Aggiungere 50 ml RL21A anticorpo biotinilato a [10 mg / ml di PBS] a tutti i pozzetti. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1,5 ore o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare la piastra 3 volte con 200 microlitri / bene PBST seguito da 3 risciacqui con 200 microlitri / pozzetto PBS come al punto 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Aggiunta di Analita <ol><li> Rimuovere la PBS e aggiungere 50 ml per pozzetto di un adeguato tampone. Per questo test, disponibile in commercio siero umano normale è stato utilizzato diluito 1:20 in PBS. </li><li> Aprire software dello scanner bioassay e seguire l&#39;installazione guidata per definire procedura sperimentale. </li><li> Inserire la piastra nello scanner bioassay e iniziare una linea di base leggere. Se questa è la prima lettura effettuata su questa piastra specifica, far funzionare scanner per equilibrare la temperatura ed eliminare la deriva della linea di base. </li><li> Dopo la linea di base è stabilizzato, o almeno 5 scansioni, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra. </li><li> Rimuovere il tampone dai pozzetti. </li><li> Controlli Spike con HLA A * 02: 01 monomero cuscinetto rilevante (FLSL) o irrilevanti (SLLV, YLEV, o KVL) peptidi a concentrazioni che vanno da [,625-10 mg / ml] in tampone. Aggiungere 50 ml di standard ai pozzetti di controllo della piastra </li><li> Aggiungere 50 ml di analita in tampone al campionepozzetti della piastra. Per questo test, a spillo siero umano disponibile in commercio è stata utilizzata. </li><li> Inserire la piastra posteriore nello scanner bioassay e riprendere la lettura fino a saturazione, di circa 30-60 min. </li><li> Pausa di lettura ed espellere la piastra. </li><li> Lavare la piastra 3 volte con 200 microlitri / bene PBST seguito da 3 risciacqui con 200 microlitri / pozzetto PBS come al punto 1.9. </li><li> Aggiungere 50 microlitri tampone a tutti i pozzetti attivi. </li><li> Inserire la piastra posteriore nello scanner bioassay e riprendere la lettura per il monitoraggio post-wash risonanza. </li><li> Fermare la lettura ed espellere la piastra. NOTA: Il tampone potrebbe essere PBS, tessuto di coltura, o di siero umano diluito 1:20 in PBS a seconda l&#39;obiettivo del test. </li></ol> Analisi 3. Dati <ol><li> Analizzare con il software dello scanner saggio biologico o esportare file di dati grezzi a preferito software di analisi statistica. Il software dello scanner saggio biologico genera automaticamente la curva vincolante basata sullalayout della piastra fornita durante l&#39;installazione sperimentale. NOTA: Se non si utilizza il software dello scanner saggio biologico per l&#39;analisi, seguire i passaggi 3,2-3,4. </li><li> Sottrarre la linea di base e il controllo negativo per ogni successivo punto dati. </li><li> Calcolare la media e la deviazione standard per i pozzi di replica per ogni punto temporale. </li><li> Genera un grafico della curva di legame o selezionare Dati finali per grafici a barre. </li></ol>

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</ol>

Gli autori, Debra Wawro Weidanz e Robert Magnusson, rispettivamente Amministratore Delegato e Chief Technology Officer di Resonant Sensori Incorporated, che produce il lettore e test piastra piastre bioassay utilizzati in questo articolo.

Il metodo descritto introduce un sistema di screening per la diagnosi del cancro biomarker che permettano la rapida individuazione di solubili complessi peptide / HLA in campioni di siero, plasma, urina o saliva di pazienti in un volume alto 96- o 384 pozzetti. Questo sistema di dosaggio utilizzando recettore delle cellule T imitando anticorpi monoclonali e un sistema di rilevamento senza etichetta taglia il tempo di analisi per meno di 1 ora rispetto a 3,5 hr mediante ELISA convenzionale. Questo approccio high-throughput consente una rapida stratificazione dei pazienti per gli studi clinici per i vaccini terapeutici del cancro o farmaci biologici. Gli attuali metodi per l&#39;individuazione di questi obiettivi di malattia richiedono purificazione per affinità e HPLC-MS / MS dei campioni individuali, un processo che richiede tempo e ingombrante. Anche se questo metodo è suscettibile di tecniche convenzionali ELISA, vi è la preoccupazione che i reagenti di rivelazione secondari come l&#39;anticorpo anti-microglobulina β2 potrebbero alterare la struttura del nascente HLUna molecola ed inibire il legame al rilevamento limitazione TCRM. Free Detection-Label allevia queste preoccupazioni. Questa procedura può essere modificata per l&#39;uso su altri sistemi senza etichetta come un sistema di risonanza plasmonica di superficie. Tuttavia, ciò ridurrebbe notevolmente le capacità di throughput superiori rispetto al sistema di saggio biologico utilizzato in questo studio. Questo protocollo può essere efficacemente modificato per l&#39;individuazione di biomarker non-HLA nel siero del paziente e plasma con aderenza ad alcuni punti critici. Il monitoraggio del processo di rivestimento anticorpo iniziale è raccomandato per l&#39;ottimizzazione della superficie, come &lt;200 pm spostamento probabilmente porterà a segnale basso per la fase successiva rilevazione. La linea di base e post-wash legge sono utili per l&#39;analisi finale, come l&#39;abbondanza di proteine ​​del siero può mascherare vincolante di bassa concentrazione dell&#39;analita. Infine, variazione di temperatura dei campioni può provocare a variazioni ben bene. Si raccomanda che tutti i campioni siano pre-incubate und il biosassay libera termoregolatore unità etichetta fissato a 2-3 ° C sopra la temperatura ambiente. Campioni refrigerati dovrebbe essere consentito un tempo sufficiente per raggiungere la temperatura di esercizio. Modifiche future di questo protocollo comprenderanno multiplexing del TCRM sulla superficie della piastra. Il sistema biologico è attualmente suscettibili di macchia di pozzetti ad una densità di almeno 8-plex. Con l&#39;introduzione di 4-8 TCRM a ciascun pozzetto, per volumi di campione di prova sono ridotti e consentire la raccolta di dati sempre più complesse per paziente. Questa capacità potrebbe informare ulteriormente i pazienti per quanto riguarda le opzioni terapeutiche.

Gli antigeni di classe I (HLA) campioni peptidi di 8-11 aminoacidi di lunghezza derivanti dalla degradazione proteasoma della proteina intracellulare repertorio e presenta questi peptidi sulla superficie di ogni cellula nucleata 1,2. Il complesso HLA è &quot;biomarker della natura&quot;, indicante la salute di ogni cella (Figura 1) per circolanti linfociti T citotossici (CTL). Il riconoscimento di malattia associata peptidi provoca l&#39;eliminazione della cellula incriminata dal CTL. Pertanto, la risposta immunitaria adattativa è altamente efficace per eliminare l&#39;infezione virale e tumore. Tuttavia, il sistema immunitario esercita una pressione che spesso promuove selezione di virus o tumore grado di eludere una risposta efficace CTL. Recettore delle cellule T (mimando TCRM) anticorpi monoclonali (MAK, MAB), che riconoscono specifici peptide / HLA-A * 02: 01 complessi, come quelli derivati ​​da proteine ​​associate al cancro al seno, fattore inibitorio migrazione di macrofagi (MIF19-27) 3 e NY-ESO-1 157-165, consentire l&#39;individuazione e la distruzione delle cellule del cancro al seno, in assenza di un anti-tumorale efficace CTL risposta 4,5. Questo lavoro rappresentativo è focalizzata sulla HLA-A * 0201 molecola, che si esprime fino al 30% della popolazione. Tuttavia, l&#39;identificazione delle altre pertinenti complessi HLA / peptide, seguita dalla produzione di TCRM consente lo sviluppo di immunoterapie mirate e diagnostica delle malattie guidata, espandendo l&#39;utilità di questo lavoro ad una popolazione molto più ampio. Una parte dei complessi peptide / HLA dirette superficie cellulare viene rilasciata nel plasma. A causa della elevata complessità del peptide / piscine HLA, gli attuali metodi per l&#39;estrazione del immunopeptidome per biomarcatori HLA associati sono tempo. Questo processo richiede la purificazione per affinità di HLA solubili dal plasma, separazione dei peptidi HLA associati da fase inversa cromatografia liquida ad alta pressione(RP-HPLC) e peptide sequenziamento mediante spettrometria di massa tandem (MS / MS) 6,7. Anche se questo processo è una valida opzione per la scoperta di nuovi bersagli terapeutici, è un processo complicato come strumento diagnostico compagno per obiettivi connessi HLA già nel vaccino terapeutico o di una condotta biofarmaceutica 8-10. TCRM diretto contro questi obiettivi forniscono gli strumenti per un rapido sviluppo compagno diagnostica volte a stratificazione dei pazienti in studi clinici rilevanti e fornire opzioni terapeutiche più informate. In questo lavoro, un sistema di screening svolta biomarker per la diagnosi del cancro è presentato che utilizza TCRM e un sistema di test biologico privo di etichetta che controlla le interazioni biologiche con minime fasi di lavorazione. Il sistema di saggio biologico senza etichetta si basa su un metodo, che utilizza l&#39;effetto di risonanza modo guidato (GMR) che si verifica in reticoli guida dielettrica 11-14. Quando la luce a banda larga di diffrazionegrattugiatura nelle piastre necessari per questo sistema, due specifiche lunghezze d&#39;onda vengono riflesse. L&#39;interazione di legame tra un recettore immobilizzato e il suo ligando è monitorata in tempo reale tracciando spostamento della lunghezza d&#39;onda di risonanza con un analizzatore di spettro 12. Picchi di risonanza separati verificano per incidente TE (vettore elettrico normale al piano di incidenza) e TM (magnetica vettore normale al piano di incidenza) stati di polarizzazione forniscono più punti di dati che possono potenzialmente aumentare la precisione di rilevamento 11,14. Utilizzando anticorpi lastre pre-sensibilizzate in questo sistema di analisi privo di etichetta, il tempo di esecuzione del test con l&#39;analisi dei dati è di circa 45 min. Inoltre, più campioni del paziente possono essere interrogati in un formato da 96 o 384 pozzetti, un chiaro vantaggio rispetto un formato basato HPLC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Sistema di rilevamento di biosaggi senza etichetta ResoSens</td><td>Sensori risonanti incorporati</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre bionetiche sensibilizzate a 96 pozzetti Avidin</td><td>Sensori risonanti integrati</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ResoVu</td><td>Sensori risonanti risonanti incorporati</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL21A TCRm biotinilato mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL9A mAb TCRm biotinilato&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLSL HLA-A*02:01 Monomero&nbsp;</td>Sequenza peptidica completa <td>esperimmune</td><td></td><td>: FLSELTQQL</td></tr><tr><td>SLLV HLA-A*02:01 Monomero&nbsp;</td>Sequenza peptidica completa <td>esperimmune</td><td></td><td>: SLLMWITQV</td></tr><tr><td>YLEV HLA-A*02:01 Monomero&nbsp;</td>Sequenza peptidica completa <td>esperimne</td><td></td><td>: YLEPGPVTV</td></tr><tr><td>KVL HLA-A*02:01 Monomero&nbsp;</td>Sequenza peptidica completa <td>experimmune</td><td></td><td>: KVLEYVIKV</td></tr><tr><td>Pooled Normal Human Serum&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2657100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Cell Supernatant</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Cellule coltivate in IMDM, 10% FBS e 1% penn/streptococco. Supernatanti raccolti da colture confluenti di 3 giorni.</td></tr>Modifica <tr><td>di Iscove del mezzo di Dulbecco (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-63</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>ThermoFisher</td><td>5318-1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato + 0,05% Tween 20 (PBST)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azinobis [acido 3-etilbenzotiazolina-6-solfonico]-sale diammonico (ABTS)</td><td>ThermoFisher</td><td>37615</td><td></td></tr><tr><td>coniglio anti-umano & beta; 2 microglobuline&nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0072</td><td></td></tr><tr><td>Perossidasi coniugata capra anti-coniglio IgG&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; micropiastre</td><td>ThermoFisher</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 lettore di micropiastre</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immpress Kit di reagenti</td><td>Vettore</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpact</td><td>DAB Vettore</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina QS</td><td>Vettore</td><td>H3403</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a</td><td>MP BioMedicals</td><td>50328</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b</td><td>MP BioMedicals</td><td>50330</td><td></td></tr><tr><td>anti-HLA-A2 (BB7.2)</td><td>Experimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento dei leucociti umani antigen biomarkers in breast cancer utilizzando libero-label biosensor tecnologia

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Secondo l&#39;American Cancer Society, più di 200.000 donne saranno con diagnosi di cancro al seno invasivo ogni anno e circa 40.000 moriranno dalla malattia. Campioni La classe antigene leucocitario umano (HLA) I peptidi derivati ​​dal proteasoma degradazione delle proteine ​​cellulari e presenta questi frammenti sulla superficie cellulare per essere interrogati dai linfociti circolanti T citotossici (CTL). Generazione di mimica recettore delle cellule T (TCRM) anticorpi monoclonali (MAK, MAB), che riconoscono il cancro al seno specifico peptide / HLA-A * 02: 01 complessi, come quelli derivati ​​dalla migrazione dei macrofagi fattore inibitorio (MIF 19-27) e NY-ESO- 1 157-165 consentire l&#39;individuazione e la distruzione delle cellule del cancro al seno, in assenza di una efficace risposta CTL anti-tumorale. Intatte classe I complessi HLA / peptide sono capannone dalle cellule di cancro al seno e rappresentano potenzialmente rilevanti biomarcatori tumorali. In questo lavoro, un sistema di screening per il cancro svolta biomarcatore diagnosticos incorporando recettore delle cellule T anticorpi monoclonali mimici combinati con un romanzo, biosensore senza etichetta che utilizza in modalità guidata di risonanza (GMR) tecnologia dei sensori è presentato. Rilevamento di capannone MIF / HLA-A * 02: 01 complessi in sovranatanti cellulari MDA-MB-231, a spillo siero umano e plasma del paziente è dimostrata. L&#39;impatto di questo lavoro potrebbe rivoluzionare la medicina personalizzata attraverso lo sviluppo della diagnostica delle malattie compagno per immunoterapie mirate.

Un insieme rappresentativo di esperimenti è stata effettuata utilizzando la ben caratterizzato TCRM, RL21A, un anticorpo murino IgG2a monoclonale che riconosce specificamente un peptide (MIF 19-27 o FLSL) nell'ambito del HLA-A * 02: 01 molecola 3. L'affine monomero peptide / HLA, nonché irrilevante HLA monomero 15, è stato utilizzato per dimostrare la procedura descritta. Figura 3 illustra il formato del dosaggio. RL21A è specifico per il monomero FLSL / HLA con crocetta reattività con altri peptide / HLA complessi 3. Questa specificità è ricapitolato usando il sistema di saggio biologico senza etichetta (Figura 4). La sensibilità del sistema di saggio biologico libera etichetta per questo esperimento è nel range nanomolare basso come determinato mediante titolazione dell'anticorpo RL21A sulla FLSL immobilizzato / HLA monomero (Figura 5). Anche se il segnale di fondo è significativamente aumentata in campioni di siero, srilevamento pecific di FLSL / HLA monomero nel siero umano spillo è raggiunto in figura 6 ed un gradiente di concentrazione è facilmente distinguibile in questi campioni. Infine, supernatanti dalla linea di cellule MDA-MB-231, mostrato in precedenza per presentare la FLSL / HLA-A * 02: 01 molecola, sono indicati per contenere solubile FLSL monomero utilizzando questa piattaforma test gratuito etichetta (Figura 7). La successiva aggiunta di FLSL / HLA monomero aumenta il segnale RL21A (Figura 7). A causa della sensibilità del sistema, oltre alla variazione ben compreso possono verificarsi come risultato di variazioni di temperatura come visto in funzione delle deviazioni standard in figure 4 e 5 turni risonanza negativi. Queste variazioni possono essere ridotti drasticamente pre-incubazione di tutti i campioni e il lettore di piastre saggio biologico ad una temperatura in leggero eccesso di temperatura ambiente (cioè, 28 ° C). In Figura 8, brevemente, 96-well lastre di polistirene sono stati rivestiti con [10 ug / ml] di RL21A per 2 ore a temperatura ambiente, lavata con PBST, bloccato con 0,5% latte magro, lavato con PBST, e incubate per 2 ore a temperatura ambiente con diluizioni seriali di FLSL HLA monomero nel siero umano normale diluito 1:10 in PBS per generare una curva standard o plasma del paziente diluito 1:10 in PBS. La piastra è stata lavata con PBST, incubate 1 ora a temperatura ambiente con coniglio β2 microglobulina anti-umano [1: 5,000] per rilevare HLA intatto, e lavato in PBST. Le piastre sono state poi incubate per 30 min con capra anti-IgG di coniglio [1: 10.000] e lavati con PBST. Rilevamento colorimetrico stata eseguita usando ABTS (2,2'-Azinobis [acido 3-ethylbenzothiazoline-6-solfonico] sale -diammonium) substrato con un tempo di incubazione 15 min e osservato a 405 nm su un lettore di micropiastre. FLSL / HLA è stata rilevata in tre campioni di pazienti. Nella Figura 8B, RL.064 plasma del paziente è stato diluito 1:20 in PBS e quindi aggiungereed alla piastra e monitorato sul rivelatore senza etichetta per 60 min. Individuazione specifica del complesso FLSL / HLA nel siero del paziente è stata compiuta. Test t di Student è stato eseguito utilizzando grafici e statistiche software (p &lt;0.05). In Figura 8C, sezioni di tessuto sono state colorate a 1 mg / ml con topo anti-HLA-A2 (BB7.2) come controllo positivo, RL21A, IgG2b e IgG2a rispettivamente come controlli negativi. La colorazione è stato rilevato utilizzando un kit anti-topo rilevamento, DAB (diaminobenzadine), e QS ematossilina per la colorazione nucleare come indicato dal produttore. La colorazione del tessuto tumorale da RL21A conferma la presentazione di complessi FLSL / HLA. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg"> Figura 1:. Tumore presentazione dell'antigene da parte dell'antigene umano leucociti classe I trasformazione cancerosa è un disordine intracellulare. Campione intracellul HLAproteine ​​AR e rivelare i cambiamenti legati al cancro alla superficie cellulare. CTL e TCRM sono in grado di riconoscere le cellule cancerose mediante complessi HLA-peptide distinte a tali cellule. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg"> Figura 2:. Schermata di acquisizione dei dati nel software dello scanner bioassay Esempio di acquisizione dati che mostra la linea di base iniziale scan seguito RL21A anticorpi Oltre a una piastra ricoperta con 10 ug / ml di complesso FLSL / HLA. Le concentrazioni di anticorpi sono come indicato. Ogni linea rappresenta un individuo ben monitorato nel tempo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg"> Figura 3:. Formato Assay Illustrazione di anticorpi immobilizzato sulla superficie del reticolo di diffrazione della rel piastra test catturaEvant peptide / complessi HLA in soluzione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg"> Figura 4: Specificità RL21A per FLSL / HLA complesso dimostrazione della specificità del biotinilato RL21A TCRM per la sua rilevante (FLSL) HLA monomero rispetto irrilevante monomero HLA (YLEV, SLLV, e KVL).. Biotinilato RL21A TCRM [10 ug / ml] è stato immobilizzato sulla superficie della piastra rivestita dosaggio avidina e la rilevazione è stata eseguita utilizzando non marcato monomero HLA rilevante o irrilevante [10 ug / ml] in PBS. RL21A era specifico per FLSL / HLA Complex. ANOVA a due vie è stata effettuata utilizzando grafici e statistiche software (p &lt;0.001). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg"> Figura 5:. Binding sensibilità del RL21A al suo peptide complesso affine / HLA Illustrazione del detectiil limite di sensibilità e RL21A legame al complesso FLSL / HLA. Biotinilato HLA Monomero FLSL [10 ug / ml] è stato immobilizzato sulla superficie della piastra del test e RL21A non marcato è stato aggiunto alla piastra in diluizioni seriali in PBS come indicato. Rilevamento di questo sistema era nell'intervallo nanomolare bassa. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg"> Figura 6: Rilevamento di HLA Complessi in Spiked Human Serum Dimostrazione della rilevazione di HLA nel siero umano.. Biotinilato RL21A TCRM [10 mg / ml] è stato immobilizzato sulla superficie della piastra test avidina rivestita. Siero umano normale pool di spillo con relativa (FLSL) o irrilevanti (SLLV) HLA monomero è stato diluito 1:20 in PBS e poi aggiunto alla piastra e monitorato sul rivelatore senza etichetta per 60 min. Individuazione specifica del complesso FLSL / HLA nel siero umano è stato compiuto. In generale, segnale di fondo (irrilevante SLLV monomero) è altoer per i campioni di siero diluiti rispetto al analiti purificate in PBS (vedi Figura 4). Due vie ANOVA è stata effettuata utilizzando grafici e statistiche software (p &lt;0,0001). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg"> Figura 7:. Complessi HLA sono stati rilevati nel cancro al seno supernatanti di colture cellulari La capacità di rilevare HLA in seno surnatanti di cellule di cancro è dimostrata. Biotinilato RL21A TCRM, RL9A TCRM (controllo negativo), e un controllo isotipico state immobilizzate sulla superficie della piastra test. Spiked [5 mg / ml] e non addizionati supernatanti di colture cellulari MDA-231 sono stati aggiunti e vincolante è stata monitorata per 60 minuti sul rivelatore senza etichetta. FLSL e SLLV HLA monomero spillo campioni rappresentano controlli positivi per RL9A e RL21A vincolanti. One-way ANOVA è stata effettuata utilizzando grafici e statistiche software (p &lt;0,0001). Figura 8:. Rilevamento specifico di complessi FLSL / HLA in campioni dei pazienti (A) Un enzima tradizionale Immunoenzimatico Assay (ELISA) è stata utilizzata per rilevare FLSL / HLA complessi specifici nel plasma dei pazienti. (B) biotilinato RL21A TCRM o IgG2a [10 mg / ml] è stato immobilizzato sul piatto test avidina. (C) tessuto tumorale del seno da RL.064 paziente era macchiato come descritto in precedenza 3 per verificare presentazione tumore dei complessi FLSL / HLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Intatte classe I complessi HLA / peptide sono capannone dalle cellule tumorali, che rappresenta un potenziale biomarcatore cancro rilevante. Utilizzando la tecnologia dei sensori senza etichetta e il recettore delle cellule T mimando anticorpi monoclonali, rilevamento di capannone MIF / HLA-A * 02: 01 complessi in sovranatanti cellulari MDA-MB-231, spillo siero umano, e plasma del paziente è dimostrata, consentendo lo sviluppo di un romanzo cancro piattaforma diagnostica.

Rilevamento dei leucociti umani Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizzando libero-Label Biosensor Tecnologia

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'antigene leucocitario umano o gli antigeni tumorali associati all'HLA nei fluidi dei pazienti per la stratificazione dei pazienti all'immunoterapia pertinente. Ciò si ottiene immobilizzando per la prima volta gli anticorpi che imitano il recettore delle cellule T, noti come TCRM, sulla superficie della MICROPIASTRA. Il secondo passo consiste nell'aggiungere il campione del paziente insieme alla diluizione seriale dei monomeri HLA del peptide bersaglio per generare una curva standard, che consente la quantificazione dell'antigene bersaglio nei campioni dei pazienti.Successivamente, il legame dell'antigene bersaglio all'anticorpo sul sistema di biodosaggio free label viene monitorato fino al raggiungimento dell'equilibrio. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i dati risultanti utilizzando la curva standard per quantificare la quantità di antigene target nei campioni dei pazienti. In definitiva, la tecnologia dei biosensori senza marcatura viene utilizzata per rilevare i biomarcatori tumorali nei campioni dei pazienti.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come lc MSS, è la rapida rilevazione ad alto rendimento degli antigeni associati all'HLA. Ciò consente la rapida stratificazione dei pazienti oncologici verso le modalità di trattamento perché funge da piattaforma di rilevamento dei biomarcatori. Sebbene questo metodo sia correlato allo screening dei biomarcatori tumorali, il sistema è in realtà applicabile a molte applicazioni, tra cui i saggi basati su cellule, lo screening ibrido di immunofenotipizzazione o lo screening di librerie di piccole molecole.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo sviluppando un anticorpo terapeutico imitatore del recettore delle cellule T. Ci siamo chiesti: come potremmo identificare i pazienti che trarrebbero il massimo beneficio da questo tipo di terapia? A dimostrare questa procedura sarà Kristen Dahl, una studentessa laureata in biotecnologie che lavora nel mio laboratorio.Iniziare pre-incubando la soluzione salina tamponata con fosfato o PBS a 28 gradi Celsius per ridurre al minimo gli spostamenti di risonanza legati alla temperatura. Aggiungere 50 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS pH 7.2 ai pozzetti delle piastre rivestite di derivati avadon. Quindi, apri il software dello scanner biologico.Segui la procedura guidata di configurazione per definire la procedura sperimentale, che include la selezione di bianchi, standard e campioni nel layout della piastra, l'impostazione della temperatura, il numero di scansioni al minuto e la durata dell'esperimento. Quindi inserire la piastra di analisi preparata nello scanner per biotest senza etichetta e avviare la prima scansione. La linea di base è il set iniziale di scansioni raccolte all'inizio dell'esperimento.Se questa è la prima lettura eseguita su questa specifica piastra, lasciare che lo scanner funzioni abbastanza a lungo da bilanciare la temperatura ed eliminare la deriva nella linea di base. Dopo che la linea di base si è stabilizzata o dopo almeno cinque scansioni, mettere in pausa la lettura ed espellere la lastra. Svuotare il PBS e aggiungere 50 microlitri di RL 21, un anticorpo biotinilato, a tutti i pozzetti sulla piastra, tranne quelli di controllo.Quindi aggiungere 50 microlitri di PBS ai pozzetti di controllo. Quindi, reinserire la piastra nello scanner per biotest e riprendere la lettura fino al raggiungimento della saturazione. Dopo circa 1,5 ore, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra.Quindi lavare la piastra tre volte con 200 microlitri per pozzetto di PBS più lo 0,05% di Tween 20 o PBST. Seguire il lavaggio con tre risciacqui da 200 microlitri per pozzetto di PBS pH 7.2 senza detersivo. Tocca il PBS in eccesso dal piatto su carta assorbente prima di passare al passaggio successivo.Quindi, aggiungere 50 microlitri di PBS a tutti i pozzetti attivi. Quindi reinserire la piastra nello scanner per biotest e riprendere la lettura per monitorare la risonanza post-lavaggio. Dopo la lettura, interrompere la lettura ed espellere la piastra.Aggiungere l'analita. Rimuovere il PBS e aggiungere 50 microlitri per pozzetto di un tampone di analisi appropriato per questo test. Il siero umano normale disponibile in commercio è stato diluito da uno a 20 in PBS.Quindi, apri il software dello scanner bioassay e segui la procedura guidata di configurazione. Per definire la procedura sperimentale, inserire la piastra nello scanner per biotest e iniziare una lettura della linea di base Dopo che la linea di base si è stabilizzata o dopo almeno cinque scansioni, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra. Quindi rimuovere il tampone di analisi dai pozzetti.Quindi aggiungere ai controlli HLAA oh 2 0 1 monomero contenente peptidi rilevanti o irrilevanti a concentrazioni comprese tra 0,625 e 10 microgrammi per millilitro in tampone di saggio. Quindi aggiungere 50 microlitri di standard ai pozzetti di controllo della piastra. Quindi, aggiungere 50 microlitri dell'analita nel tampone di analisi ai pozzetti del campione della piastra.Per questo test è stato utilizzato siero umano addizionato disponibile in commercio. Reinserire la piastra nello scanner per biotest e riprendere la lettura fino a raggiungere la saturazione circa 30-60 minuti dopo la saturazione, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra. Procedere al lavaggio della piastra tre volte con 200 microlitri per pozzetto di PBST, seguito da tre risciacqui con 200 microlitri per pozzetto di PBS come prima, quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di saggio a tutti i pozzetti attivi.Ora reinserite la piastra nello scanner per biotest e riprendete la lettura per monitorare la risonanza post-lavaggio prima di interrompere la lettura ed espellere la piastra. Infine, analizza i dati utilizzando il software di scansione del biodosaggio o esporta i file di dati grezzi nel software di analisi statistica preferito. Il software dello scanner per biosaggi genera automaticamente la curva di legame in base al layout della piastra fornito durante la configurazione sperimentale.La biotinila RL 21 A-T-C-R-M o IgG two A è stata immobilizzata sulla piastra del test AVID AVIDAN I risultati rappresentativi mostrano il rilevamento dell'antigene tumorale bersaglio F-L-S-L-H-L-A in un campione di plasma del paziente all'equilibrio e al post lavaggio. IgG due A viene utilizzato come controllo per sezioni di tessuto legante non specifiche colorate con un controllo positivo e controlli negativi. E per RL 21 una colorazione del tessuto tumorale con RL 21 A conferma la presentazione dei complessi F-L-S-L-H-L-A.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i biomarcatori associati all'HLA nei fluidi dei pazienti utilizzando gli anticorpi che imitano il recettore delle cellule T e monitorando il legame dell'antigene bersaglio all'anticorpo sul sistema di biodosaggio label-free. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di incubare tutti i tamponi del campione prima dell'uso per evitare picchi di temperatura e di utilizzare il tampone del campione corretto per ogni fase.

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