Rilevamento dei leucociti umani Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizzando libero-Label Biosensor Tecnologia

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'antigene leucocitario umano o gli antigeni tumorali associati all'HLA nei fluidi dei pazienti per la stratificazione dei pazienti all'immunoterapia pertinente. Ciò si ottiene immobilizzando per la prima volta gli anticorpi che imitano il recettore delle cellule T, noti come TCRM, sulla superficie della MICROPIASTRA. Il secondo passo consiste nell'aggiungere il campione del paziente insieme alla diluizione seriale dei monomeri HLA del peptide bersaglio per generare una curva standard, che consente la quantificazione dell'antigene bersaglio nei campioni dei pazienti.

Successivamente, il legame dell'antigene bersaglio all'anticorpo sul sistema di biodosaggio free label viene monitorato fino al raggiungimento dell'equilibrio. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i dati risultanti utilizzando la curva standard per quantificare la quantità di antigene target nei campioni dei pazienti. In definitiva, la tecnologia dei biosensori senza marcatura viene utilizzata per rilevare i biomarcatori tumorali nei campioni dei pazienti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come lc MSS, è la rapida rilevazione ad alto rendimento degli antigeni associati all'HLA. Ciò consente la rapida stratificazione dei pazienti oncologici verso le modalità di trattamento perché funge da piattaforma di rilevamento dei biomarcatori. Sebbene questo metodo sia correlato allo screening dei biomarcatori tumorali, il sistema è in realtà applicabile a molte applicazioni, tra cui i saggi basati su cellule, lo screening ibrido di immunofenotipizzazione o lo screening di librerie di piccole molecole.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo sviluppando un anticorpo terapeutico imitatore del recettore delle cellule T. Ci siamo chiesti: come potremmo identificare i pazienti che trarrebbero il massimo beneficio da questo tipo di terapia? A dimostrare questa procedura sarà Kristen Dahl, una studentessa laureata in biotecnologie che lavora nel mio laboratorio.

Iniziare pre-incubando la soluzione salina tamponata con fosfato o PBS a 28 gradi Celsius per ridurre al minimo gli spostamenti di risonanza legati alla temperatura. Aggiungere 50 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS pH 7.2 ai pozzetti delle piastre rivestite di derivati avadon. Quindi, apri il software dello scanner biologico.

Segui la procedura guidata di configurazione per definire la procedura sperimentale, che include la selezione di bianchi, standard e campioni nel layout della piastra, l'impostazione della temperatura, il numero di scansioni al minuto e la durata dell'esperimento. Quindi inserire la piastra di analisi preparata nello scanner per biotest senza etichetta e avviare la prima scansione. La linea di base è il set iniziale di scansioni raccolte all'inizio dell'esperimento.

Se questa è la prima lettura eseguita su questa specifica piastra, lasciare che lo scanner funzioni abbastanza a lungo da bilanciare la temperatura ed eliminare la deriva nella linea di base. Dopo che la linea di base si è stabilizzata o dopo almeno cinque scansioni, mettere in pausa la lettura ed espellere la lastra. Svuotare il PBS e aggiungere 50 microlitri di RL 21, un anticorpo biotinilato, a tutti i pozzetti sulla piastra, tranne quelli di controllo.

Quindi aggiungere 50 microlitri di PBS ai pozzetti di controllo. Quindi, reinserire la piastra nello scanner per biotest e riprendere la lettura fino al raggiungimento della saturazione. Dopo circa 1,5 ore, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra.

Quindi lavare la piastra tre volte con 200 microlitri per pozzetto di PBS più lo 0,05% di Tween 20 o PBST. Seguire il lavaggio con tre risciacqui da 200 microlitri per pozzetto di PBS pH 7.2 senza detersivo. Tocca il PBS in eccesso dal piatto su carta assorbente prima di passare al passaggio successivo.

Quindi, aggiungere 50 microlitri di PBS a tutti i pozzetti attivi. Quindi reinserire la piastra nello scanner per biotest e riprendere la lettura per monitorare la risonanza post-lavaggio. Dopo la lettura, interrompere la lettura ed espellere la piastra.

Aggiungere l'analita. Rimuovere il PBS e aggiungere 50 microlitri per pozzetto di un tampone di analisi appropriato per questo test. Il siero umano normale disponibile in commercio è stato diluito da uno a 20 in PBS.

Quindi, apri il software dello scanner bioassay e segui la procedura guidata di configurazione. Per definire la procedura sperimentale, inserire la piastra nello scanner per biotest e iniziare una lettura della linea di base Dopo che la linea di base si è stabilizzata o dopo almeno cinque scansioni, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra. Quindi rimuovere il tampone di analisi dai pozzetti.

Quindi aggiungere ai controlli HLAA oh 2 0 1 monomero contenente peptidi rilevanti o irrilevanti a concentrazioni comprese tra 0,625 e 10 microgrammi per millilitro in tampone di saggio. Quindi aggiungere 50 microlitri di standard ai pozzetti di controllo della piastra. Quindi, aggiungere 50 microlitri dell'analita nel tampone di analisi ai pozzetti del campione della piastra.

Per questo test è stato utilizzato siero umano addizionato disponibile in commercio. Reinserire la piastra nello scanner per biotest e riprendere la lettura fino a raggiungere la saturazione circa 30-60 minuti dopo la saturazione, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra. Procedere al lavaggio della piastra tre volte con 200 microlitri per pozzetto di PBST, seguito da tre risciacqui con 200 microlitri per pozzetto di PBS come prima, quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di saggio a tutti i pozzetti attivi.

Ora reinserite la piastra nello scanner per biotest e riprendete la lettura per monitorare la risonanza post-lavaggio prima di interrompere la lettura ed espellere la piastra. Infine, analizza i dati utilizzando il software di scansione del biodosaggio o esporta i file di dati grezzi nel software di analisi statistica preferito. Il software dello scanner per biosaggi genera automaticamente la curva di legame in base al layout della piastra fornito durante la configurazione sperimentale.

La biotinila RL 21 A-T-C-R-M o IgG two A è stata immobilizzata sulla piastra del test AVID AVIDAN I risultati rappresentativi mostrano il rilevamento dell'antigene tumorale bersaglio F-L-S-L-H-L-A in un campione di plasma del paziente all'equilibrio e al post lavaggio. IgG due A viene utilizzato come controllo per sezioni di tessuto legante non specifiche colorate con un controllo positivo e controlli negativi. E per RL 21 una colorazione del tessuto tumorale con RL 21 A conferma la presentazione dei complessi F-L-S-L-H-L-A.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i biomarcatori associati all'HLA nei fluidi dei pazienti utilizzando gli anticorpi che imitano il recettore delle cellule T e monitorando il legame dell'antigene bersaglio all'anticorpo sul sistema di biodosaggio label-free. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di incubare tutti i tamponi del campione prima dell'uso per evitare picchi di temperatura e di utilizzare il tampone del campione corretto per ogni fase.