Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere ovaie neonatali e/o singoli follicoli ovarici in vitro. Ciò si ottiene sezionando prima le ovaie da femmine fredde dell'età appropriata. Il secondo passo consiste nel preparare il tessuto, compresa la dissezione fine dei singoli follicoli ovarici con aghi per agopuntura.

Quindi le ovaie neonatali o i singoli follicoli pre-antrali vengono coltivati con alimentazione regolare e il passaggio finale consiste nel fissare o congelare il tessuto per l'analisi istologica o molecolare. In definitiva, il sistema di coltura supporta lo sviluppo in modo altamente fisiologico e può essere utilizzato per esaminare la regolazione dello sviluppo del follicolo ovarico e per studiare le interazioni tra i follicoli ovarici primordiali e quelli in crescita. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i follicoli ovarici intatti vengono supportati durante lo sviluppo dei follicoli, mantenendo la loro struttura tridimensionale senza la necessità di matrici di supporto.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia ovarica e anche per aiutare a studiare gli effetti di composti tossici come la chemioterapia, i farmaci sull'ovaio e quindi la fertilità femminile. Abbiamo avuto l'idea di co-coltivare diverse età e quindi fasi dei follicoli ovarici quando abbiamo discusso su come studiare gli effetti della crescita dei follicoli sul pool di follicoli primordiali a riposo, a dimostrare la tecnica insieme a Steph Morgan e Lisa Campbell saranno Vivian Allison, un tecnico del laboratorio e Allison Murray, che è stata una scienziata post-dottorato in laboratorio per molti anni. Entrambi hanno contribuito a sviluppare gli aspetti chiave della tecnica per estrarre le pipette per questo protocollo.

Scaldare e piegare le pipette di vetro su una fiamma ed eseguire un taglio netto con un tagliavetro. Quindi sterilizzare il vetro curvo a 160 gradi Celsius per circa 45 minuti. Ci vuole pratica per ottenere la giusta curva della pipetta per la tua tecnica.

Tagliare sempre la pipetta con un tagliavetro in modo che non ci siano vetri frastagliati. Vuoi anche assicurarti di avere l'estremità con il diametro giusto per il tuo tessuto Costruito per sterilizzare il terreno di dissezione in lebowitz L 15 con BSA attraverso un filtro da 0,2 micron. Cioè 25 millimetri di diametro costruiti per sterilizzare la coltura ovarica neonatale.

Filtra attraverso un altro filtro da 0,2 micron di soli 25 millimetri di diametro e raccoglilo in un tubo sterile. Quindi aggiungere un millilitro di terreno neonatale a ciascun pozzetto di un 24. Impiattare bene e trasferire una membrana sulla superficie del terreno in ogni pozzetto.

Anche il terreno di coltura follicolare viene sterilizzato con filtro come il terreno di coltura ovarica. Quindi anche l'olio siliconico deve essere sterilizzato con filtro. Quindi, riparare le piastre di coltura a 96 pozzetti con 30 gocce da microlitro del terreno follicolare lungo la fila superiore.

Ricopri accuratamente questi pozzetti con 70 microlitri di olio di silicio. In alternativa, la co-coltura del follicolo richiede 100 microlitri di terreno con una sovrapposizione di 100 microlitri di olio di silicone. Quindi preparare piastre di co-coltura dell'ovaio follicolare con un millilitro di terreno per pozzetto e una membrana nucleare sterilizzata UV posizionata con molta attenzione.

Inizia trasferendo un millilitro di terreno di dissezione in ogni piatto di vetro sterile per embrioni. Dopo aver colorato i cuccioli di età da zero a cinque giorni dopo la nascita, afferrare la pelle che copre la parete addominale con una pinza sottile e incidere la pelle e la parete del corpo. Aprire questa grande incisione esponendo l'addome.

La vescica è solitamente gonfia in questa fase e può essere perforata per facilitare la dissezione. Usando una pinza da orologiaio, sposta le budella. Quindi, su entrambi i lati, segui le corna uterine dalla vescica fino al rene.

L'ovaio è una struttura simile a una nuvola situata appena sotto il rene nella parte superiore dell'utero. Afferrare l'ovaio delicatamente e usando le forbici. Taglialo dall'utero.

Dopo aver sezionato entrambe le ovaie, trasferirle in piatti pieni di dissezione calda. Medio. Utilizzare un microscopio da dissezione con un tavolino riscaldato a 37 gradi Celsius per sezionare le ovaie utilizzando aghi da insulina. Taglia via il sacco basale e tutto il materiale in eccesso, comprese le tube di Falloppio fino a quando non rimane solo l'ovaio.

Quindi trasferire ogni ovaia nel pozzetto di una piastra preparata utilizzando una pipetta curva. Posizionare un'ovaia su ciascuna coltura di membrana, il tessuto cambia metà del terreno a giorni alterni per un massimo di sei giorni. Quando si cambia il terreno, posizionare la punta della pipetta sul bordo del pozzetto del terreno per evitare di disturbare la membrana. Dopo la coltura, le ovaie possono essere conservate congelate o fissate o istologie o immunochimiche.

Dopo aver raccolto le ovaie dai topi più anziani in una capsula di terreno di dissezione caldo, rimuovere la Basa ovarica. Usa gli aghi da insulina per tagliare via il sacco basale e il materiale in eccesso, comprese le tube di Falloppio, fino a quando non rimane solo l'ovaio. Quindi tagliare le ovaie a metà usando gli aghi e trasferire con cura ciascuna metà in un vetro da orologio individuale contenente un millilitro di mezzo di dissezione.

Copri i vetri dell'orologio con un vetrino e conservali in forno per un massimo di un'ora il prima possibile. Lavorando al microscopio con un tavolino riscaldato in una cappa a flusso di lamina, sezionare le ovaie in pezzi di grandi dimensioni utilizzando aghi da insulina per identificare i follicoli pre-antali tardivi. I follicoli pre-antali contengono da due a tre strati di cellule di granulosi e hanno un diametro di circa 180-200 micrometri.

Sezionare uno di questi utilizzando un ago in linea e un ago per agopuntura fissato da un portaago, evitare di danneggiare la lamina basale, ma assicurarsi di rimuovere lo stroma S circostante. Questo richiede pratica. Il follicolo ha bisogno di un po' di tessuto fecale, ma non troppo.

Inoltre, se il processo di dissezione è troppo ruvido, il follicolo si danneggia e si rompe o muore. Durante la coltura, l'utente ha preparato perpe per trasferire con cura i follicoli in un nuovo vetro dell'orologio riempito di medium. Mantenere i follicoli sulla sezione di calibro sottile del perpet utilizzando un oculare calibrato montato su un microscopio da dissezione.

Misura i follicoli. Se si trovano entro 10 micrometri da un diametro di 190 micrometri. Potrebbero essere utilizzati per la coltura, scartare gli altri follicoli dai follicoli selezionati.

Scegli solo il più sano per la coltivazione. Dovrebbero essere traslucidi, senza aree retiche più scure, avere una lamina basale intatta e un po' di tessuto tecale attaccato. Una buona resa è di 10-15 follicoli per ovaio.

Ora, utilizzando una perpa curva preparata, trasferire questi follicoli nella piastra di coltura a 96 pozzetti preparata. Posizionare un follicolo in ogni pozzetto sotto lo strato di olio e la coltura. I follicoli sono fino a sei giorni al giorno.

Preparare una nuova riga con i supporti. Un'ora o più dopo, trasferire i follicoli nella fila successiva di terreno fresco ed equilibrato o colture di cocolture di follicoli follicoli due follicoli fianco a fianco in uno. Bene, invece dei trasferimenti, usa una punta di gel fine per cambiare metà del mezzo a giorni alterni.

Per l'ovaio follicolare, le cocolture trasferiscono un follicolo in un'ovaia neonatale posizionata su una membrana in una piastra di coltura, posizionando con cura il follicolo accanto a un polo dell'ovaio neonatale in modo che possano poi essere spostati in contatto l'uno con l'altro. Mantieni questa cultura per un massimo di cinque giorni. Sostituzione di 500 microlitri del mezzo a giorni alterni.

I follicoli pre-antali spesso vengono incapsulati dalle ovaie neonatali. Durante questa coltura, le ovaie neonatali del neonato sono state coltivate per sei giorni ed esposte a sostanze tossiche per la riproduzione. Il secondo giorno di coltura, i tessuti sono stati processati per determinare il numero e la salute dei diversi stadi dei follicoli.

Una sostanza tossica studiata era il cisplatino. L'altra sostanza tossica studiata è stata la doxorubicina. Un altro esperimento ha studiato l'effetto della gonadotropina, dell'ormone follicolo-stimolante e dell'ormone luteinizzante sulla crescita dei singoli follicoli.

Ma questa analisi le dimensioni dei follicoli sono state misurate periodicamente per mappare la loro crescita. La co-coltura del follicolo è stata studiata utilizzando un follicolo che esprime GFP e un processo follicolare di tipo selvatico che si estende da uno all'altro. L'elaborazione immunoistochimica di questa co-coltura ha rivelato che i processi GFP si trovano all'interno dei tipi selvatici.

Anche lo strato tecale, le ovaie neonatali wild type erano in co-coltura con il follicolo che esprime GFP. In questo scenario, i processi GFP sono migrati attraverso l'interstizio ovarico. La coltura dell'ovaio neonatale è un metodo abbastanza semplice, ma aspettatevi di dedicare un po' di tempo alla padronanza della tecnica di sezionamento dei follicoli pre-antrali intatti non danneggiati.

Questo è essenziale per il loro corretto sviluppo. Dopo la coltura del follicolo, gli ovociti possono essere fecondati mediante fecondazione in vitro, dopodiché gli embrioni possono essere trasferiti in femmine pseudo gravide e ottenere piccoli vivi.